【摘要】：背景:乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)主要分布在東南亞與太平洋西部地區(qū),每年約有數(shù)萬人感染乙型腦炎病毒,病死率在25%左右。乙型腦炎是以三帶喙庫蚊為主要傳播媒介,嚴(yán)重威脅人畜健康的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病。豬是乙型腦炎病毒的重要貯存宿主和增殖宿主,也是乙型腦炎的主要傳染源。乙型腦炎可引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎等繁殖障礙,也可引起公豬急性睪丸炎或不育,疾病通常在“蚊-豬-蚊”等動(dòng)物間循環(huán)。遼寧省豬源乙型腦炎相關(guān)方面的研究還不夠深入,因此有必要開展豬源乙型腦炎病毒血清學(xué)檢測以及分子生物學(xué)的研究。目的:本研究主要通過血清學(xué)檢測了解遼寧省部分地區(qū)乙型腦炎病毒在宿主動(dòng)物豬體內(nèi)的感染情況,通過對(duì)豬乙型腦炎病毒的分離鑒定,解析我省豬源乙型腦炎病毒毒株的基因型以及主要基因變異和遺傳進(jìn)化,為進(jìn)一步防控豬群和人的乙型腦炎提供一定理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。方法:采集豬血清樣本,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行乙型腦炎病毒血清IgG抗體檢測,檢測抗體陰性的豬血清樣本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(抗體陽性說明機(jī)體已感染,感染后病毒被抑制中和,不能再分離出病毒),從病變的細(xì)胞中提取病毒RNA,并采用豬乙型腦炎病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒定,對(duì)陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序,測序結(jié)果與Genbank中乙型腦炎病毒相關(guān)參考株基因進(jìn)行比對(duì)分析,并構(gòu)建乙型腦炎病毒遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果:1、2018年,在遼寧省部分地區(qū)共采集347份豬血清樣本進(jìn)行乙型腦炎病毒血清IgG抗體檢測,結(jié)果乙型腦炎病毒血清IgG抗體陽性數(shù)為195份,陽性率為56.2%,為確定豬群乙型腦炎病毒感染情況提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。2、在152份豬血清乙型腦炎病毒IgG抗體陰性樣本中分離出一株GⅠ型乙型腦炎病毒,將經(jīng)RT-PCR鑒定乙型腦炎病毒獲得的產(chǎn)物進(jìn)行基因測序,用DNAStar等生物學(xué)軟件分析表明,該分離株與Genbank中國內(nèi)外乙型腦炎病毒代表毒株E基因的核苷酸同源性在77.3%-99.3%之間,氨基酸同源性在91.0%-99.8%之間,其中與疫苗株SA14-14-2的E基因核苷酸序列同源性為87.8%,編碼的氨基酸同源性為97.2%。該毒株與疫苗株SA14-14-2的E基因編碼Domain區(qū)有13個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異,Domain區(qū)段外有1個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異。這是我省首次從豬血中分離到乙型腦炎病毒,為宿主動(dòng)物豬源乙型腦炎病毒分子生物學(xué)特性研究奠定了基礎(chǔ),有利于研發(fā)乙型腦炎疫苗,保障人畜健康,提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。結(jié)論:遼寧省豬群乙型腦炎感染率較高,應(yīng)加強(qiáng)豬群的血清學(xué)檢測,以便及時(shí)掌握豬群乙型腦炎感染情況。分離到的GⅠ型乙型腦炎病毒與疫苗株SA14-14-2的E基因相比共有14個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異,提示該次分離到的豬源乙型腦炎病毒分離株部分核苷酸發(fā)生變異,該結(jié)果為研究乙型腦炎病毒的分子生物學(xué)特性,以及防止乙型腦炎的發(fā)生與流行,保證人畜健康,促進(jìn)公共衛(wèi)生安全有著重要意義。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28
【圖文】：

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文表現(xiàn)為輕型感染或隱性感染，只有少數(shù)人感染后引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，發(fā)生腦常以10歲以下的兒童和60歲以上的老年人發(fā)病較多，這可能是由于兒童的自身免發(fā)育不完善，老年人大多數(shù)沒有進(jìn)行免疫接種和自身免疫力較低引起的（楊芳等因兒童計(jì)劃免疫的實(shí)施，降低了兒童乙型腦炎的發(fā)病率。目前乙型腦炎發(fā)病多為這部分人群多生活在農(nóng)村或者城鄉(xiāng)結(jié)合部且居住環(huán)境衛(wèi)生狀況較差，預(yù)防意識(shí)薄加了乙型腦炎發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)（朱冉與胡泊，2017）。

成熟的M蛋白是在病毒粒子成熟的過程中由prM切割而來（呂順燕等，2017；2017），對(duì)維持E蛋白結(jié)構(gòu)有必要作用（Liu X Y et al，2019）。糖基化包膜蛋白蛋白（M）形成二十面體衣殼嵌入在磷脂雙分子層。E蛋白是較大的結(jié)構(gòu)蛋白（ al，2016），得到廣泛的研究，由500個(gè)氨基酸殘基組成，具有兩個(gè)潛在的糖基分子量為53kD（祖立闖等，2010）。E蛋白是乙型腦炎病毒主要的囊膜蛋白（Ml，2018），參與許多重要的生物學(xué)過程，包括病毒粒子的組裝、吸附、致病、膜宿主的免疫應(yīng)答、血凝和病毒中和等過程（Barnali Natha et al，2017）。E蛋白簇包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是結(jié)構(gòu)域Ⅰ（DomainⅠ）、結(jié)構(gòu)域Ⅱ（DomainⅡ）和結(jié)構(gòu)omainⅢ）（Fan J et al，2013），其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ含有糖基化位點(diǎn)和生物活性的抗原1-51位、E137-196位和E293-311位共計(jì)128個(gè)不連續(xù)的氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)域凝抗原活性的表位，由E52-136位和E197-292位共計(jì)171個(gè)不連續(xù)的氨基酸殘而結(jié)構(gòu)域Ⅲ包含了乙型腦炎病毒主要的特異性表位，與受體結(jié)合有關(guān)（Han N5），能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的膜融合，由E310-411位共計(jì)100個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基e F F et al，2008；Lei Y et al，2018）。E蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生血凝抑制抗體和中Brian Nickols et al，2017），可作為RT-PCR檢測的材料。

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬血清接種白紋伊蚊卵細(xì)胞系（C6/36）后，在 72h 開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，接毒的單層細(xì)胞折光性增強(qiáng)，少數(shù)細(xì)胞聚集成叢，突出于單層細(xì)胞表面，96-120h 細(xì)胞病變更為明顯細(xì)胞脫落、聚集、圓縮，可達(dá) 75%以上，脫落的細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。如下圖所示顯微鏡（×100）下正常的 C6/36 細(xì)胞和接毒后病變的 C6/36 細(xì)胞對(duì)照比較。

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本文編號(hào)：2750069