【摘要】：近年來(lái)新發(fā)傳染病屢有發(fā)生,全球近75%的新發(fā)傳染病是動(dòng)物源性的。嚙齒目動(dòng)物作為全球種類(lèi)最多、分布最廣的哺乳動(dòng)物種群,它們與人類(lèi)密切接觸,是各種新發(fā)病毒的自然儲(chǔ)庫(kù),可傳播60多種已知的人畜共患傳染病。因此我們對(duì)我國(guó)嚙齒目動(dòng)物攜帶的病毒組進(jìn)行了大規(guī)模系統(tǒng)性的研究,該課題作為嚙齒目動(dòng)物病毒組研究的一部分聚焦于指環(huán)病毒。由于缺乏有效的細(xì)胞系模型和合適的動(dòng)物模型來(lái)支持病毒復(fù)制研究,指環(huán)病毒的致病性仍然存在爭(zhēng)議,但是目前其中的一些基因型被認(rèn)為具有致病能力。近年來(lái)指環(huán)病毒已相繼從人類(lèi)及其他哺乳動(dòng)物中檢出。嚙齒類(lèi)動(dòng)物指環(huán)病毒之前已在英國(guó)報(bào)道過(guò),然而目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有關(guān)于嚙齒動(dòng)物攜帶指環(huán)病毒的報(bào)道,因此對(duì)于了解不同地區(qū)的多種嚙齒目動(dòng)物的指環(huán)病毒的存在情況是十分必要的。在本研究中,我們利用宏基因組學(xué)研究方法,對(duì)我國(guó)20個(gè)代表性省份的5個(gè)科的42種嚙齒目動(dòng)物,共計(jì)2416份咽拭子和肛拭子樣品的指環(huán)病毒的存在情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示幾乎所有的嚙齒目動(dòng)物都攜帶有指環(huán)病毒,擴(kuò)充了嚙齒目動(dòng)物攜帶指環(huán)病毒的宿主種類(lèi)。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果提示,結(jié)合巢式PCR方法對(duì)原始樣本中的指環(huán)病毒基因序列進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證,并根據(jù)序列相似性選擇具有代表性的序列進(jìn)行全基因擴(kuò)增,最終得到了 11個(gè)代表性的全基因組和2個(gè)部分基因組序列信息。我們獲得的嚙齒目動(dòng)物指環(huán)病毒基因組長(zhǎng)度約有2.3kb-2.6kb。根據(jù)序列拼接和基因注釋結(jié)果,本研究獲得的指環(huán)病毒基因組包含2-3個(gè)開(kāi)放閱讀框,此外還包括一個(gè)495-868bp的非編碼區(qū)。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)13個(gè)指環(huán)病毒ORF1的進(jìn)化分析,嚙齒類(lèi)動(dòng)物指環(huán)病毒形成了 4個(gè)譜系(1-4),根據(jù)序列同源性、系統(tǒng)進(jìn)化及基因組結(jié)構(gòu)等分析結(jié)果,建議其與英國(guó)的嚙齒目動(dòng)物指環(huán)病毒構(gòu)成3個(gè)新的病毒屬,這些新發(fā)現(xiàn)的指環(huán)病毒擴(kuò)展了病毒學(xué)的分類(lèi)。本研究表明鼠科的小家鼠攜帶嚙齒目動(dòng)物指環(huán)病毒毒株RtMm-AneV/ZJ2016,這提示同一種屬的實(shí)驗(yàn)室小鼠也可能被該毒株感染而用于研究指環(huán)病毒的復(fù)制周期和致病性。本研究中概述了嚙齒目動(dòng)物指環(huán)病毒并鑒定出中國(guó)嚙齒目動(dòng)物攜帶的13種新型指環(huán)病毒。這些數(shù)據(jù)可以為識(shí)別和追蹤嚙齒目動(dòng)物攜帶潛在的指環(huán)病毒提供重要的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

具有很高的人畜共患風(fēng)險(xiǎn)。在城市郊區(qū)，嚙齒目動(dòng)物作為連接人類(lèi)和野生動(dòng)物的媒逡逑介，在這些自然生態(tài)系統(tǒng)中，人類(lèi)往往暴露于一些人畜共患病病原的自然疫源地中。逡逑嚙齒目動(dòng)物傳播傳染病的途徑分成直接傳播和間接傳播兩種（圖１）。直接傳播途逡逑徑是嚙齒目動(dòng)物通過(guò)多種方式直接將病毒傳播給人類(lèi)，包括抓咬人、人食入被嚙齒逡逑目動(dòng)物糞便污染的食物或水以及吸入其糞便、尿等污染物所形成的氣溶膠顆粒；間逡逑接傳播途徑是嚙齒目動(dòng)物通過(guò)體外寄生的節(jié)肢動(dòng)物如蜱、圣、螨等媒介動(dòng)物間接將逡逑病毒傳播給人類(lèi)。在這種傳播方式中，嚙齒目動(dòng)物主要作為儲(chǔ)存宿主，通過(guò)媒介動(dòng)逡逑６逡逑

編碼區(qū)組成，該編碼區(qū)含有至少三個(gè)開(kāi)放閱讀框（ＯＲＦ）和約１．２ｋｂ（ＴＴＳｕＶ中０．８ｋｂ）逡逑的非翻譯區(qū)（ＵＴＲ），其富含ＧＣ區(qū)域［３７］。高度保守的ＵＴＲ區(qū)域含有ＴＡＴＡ盒和ｐｏｌｙＡ逡逑尾部序列，它被用作轉(zhuǎn)錄因子，依賴(lài)于不同的細(xì)胞系呈現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄活性（圖２）。逡逑含有ＴＴＶ完整基因組構(gòu)建體的質(zhì)粒在ＣＯＳ１細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ），然后逡逑得到了三個(gè)不同長(zhǎng)度的信使ＲＮＡ分別為３．０ｋｂ，１．２ｋｂ和ｌ．Ｏｋｂ。這三個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物起逡逑始于ＴＡＴＡ框附近的同一個(gè)區(qū)域，也使用相同的編碼區(qū)末端的Ｐｏｌｙ（Ａ）信號(hào)。所有的逡逑轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用相同的剪切位點(diǎn)形成信使ＲＮＡ，只有３．０ｋｂ的ｍＲＮＡ具有完整的逡逑ＯＲＦ１，１．２ｋｂ和ｌ．Ｏｋｂ的ｉｎＲＮＡ發(fā)生了二次剪切，將ＯＲＦ２與同一個(gè)閱讀框內(nèi)的逡逑ＯＲＦ４連接到一起［２９］。０１１？１編碼的約７００－７７０個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是病毒衣殼逡逑蛋白［１６］。ＯＲＦ２編碼約２００個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在一些基因型中，它被分成更小的逡逑ＯＲＦ２ａ和ＯＲＦ２ｂ，后者含有類(lèi)似于蛋白酪氨酸磷酸酶的ＣＡＶ－ｌｉｋｅ保守氨基酸基序，逡逑其可能參與自然感染期間細(xì)胞和／或病毒蛋白質(zhì)調(diào)控和處理［３８］。ＯＲＦ３的產(chǎn)物是２８５逡逑個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)

實(shí)為８９個(gè)不同地區(qū)不同鼠種的混合樣品）�；旌虾蟮臉颖纠茫龋椋螅澹瘢玻担埃皽y(cè)序平臺(tái)逡逑進(jìn)行測(cè)序，樣品經(jīng)“過(guò)濾－富集－核酸酶消化－病毒核酸提取”策略后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增構(gòu)建ｃＤＮＡ文庫(kù)，部分樣本的跑膠結(jié)果如圖３．２所示，我們切�。担埃埃保埃埃埃猓鸬腻义掀�，Ｑｕｂｉｔ邋定量大于邋２０ｎｇ／ｎｌ，ＮａｎｏＤｒｏｐ邋定量邋ＯＤ２６０／２８０邋為邋１．８－２．０，邋ＯＤ２６０／２３０逡逑為２．２－２．３，符合上機(jī)要求，產(chǎn)物很純，無(wú)蛋白、酚類(lèi)等有機(jī)物的污染。然后用Ｂｉｏｍｐｔｏｒ逡逑進(jìn)行片段化，設(shè)置頻率Ｈ，打３０ｓ，間隔ｌｍｉｎ，每隔１５ｍｉｎ換一次薄冰水，將打斷逡逑管中液體離心后再次進(jìn)行打斷，共反復(fù)進(jìn)行４次，即打斷１小時(shí)。為保證ｃＤＮＡ文逡逑庫(kù)已經(jīng)片段化且可以進(jìn)行后續(xù)步驟，需進(jìn)行２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析，按標(biāo)準(zhǔn)操作流逡逑程，完成ｃＤＮＡ文庫(kù)末端修復(fù)、加Ａ、加接頭等步驟后需再一次進(jìn)行２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ逡逑分析。圖３．３－３．４為ｃＤＮＡ文庫(kù)進(jìn)行的上機(jī)測(cè)序前２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ定性定量部分結(jié)逡逑果。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋Ｆｉｌｅ邋Ｒｕｎ邋Ｓｕｍｍａｒｙ為混合樣品電泳圖。下方為每個(gè)混合樣品的逡逑２１００分析結(jié)果，橫坐標(biāo)為測(cè)序片段長(zhǎng)度分布，縱坐標(biāo)為測(cè)序片段峰度大小。逡逑Ｍ邋樣本１樣本２邋Ｎ逡逑２０００逡逑７５０邋Ｃ３逡逑２５０逡逑１００逡逑圖３．２邋ｃＤＮＡ產(chǎn)物電泳結(jié)果。Ｍ：邋Ｍａｒ

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本文編號(hào)：2749438