【摘要】：研究目的 牦牛是高原特有物種,依據(jù)其自身的解剖學(xué)和生理學(xué)特性能夠很好地適應(yīng)高原的特殊環(huán)境。存活素(Survivin)作為凋亡抑制蛋白(IAP)家族最小成員既能參與細(xì)胞的增殖分化也能參與細(xì)胞的凋亡代謝。Caspase-3作為凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵因子對(duì)疾病和細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用。本文通過研究survivin生物信息學(xué)特性,及其在新生和成年健康牦牛各組織器官中的表達(dá)差異,并分析survivin和caspase-3在三個(gè)年齡組免疫器官的基因和蛋白表達(dá)水平及特異性定位,為進(jìn)一步研究survivin對(duì)牦牛不同組織器官,尤其是機(jī)體免疫功能的調(diào)控機(jī)理提供重要的理論依據(jù)。此外,本文通過構(gòu)建survivin重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,并制備良好的兔源多克隆抗體。為進(jìn)一步開展牦牛survivin相關(guān)研究及牦牛機(jī)體其他因子抗體的制備奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法1.試驗(yàn)材料:健康牦牛(新生組,2-5日齡,n=5;半歲組,5-7月齡,n=5;成年組,3-4歲,n=5)組織器官(心臟,肝臟,肺臟,大腦,腎臟,睪丸,脾臟,淋巴結(jié)及胸腺),成年大耳白兔,n=4。2.試驗(yàn)方法:(1)采用RT-PCR方法克隆牦牛survivin編碼區(qū)基因,利用生物信息學(xué)軟件及官方網(wǎng)站對(duì)目的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)(IHC)方法對(duì)survivin在新生和成年組牦牛不同組織器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦和睪丸)中的基因、蛋白水平和陽性定位情況進(jìn)行分析。并用SPSS21.0軟件的單因素方差分析法對(duì)survivin基因和蛋白的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析。(3)采用qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)方法對(duì)survivin和caspase-3在新生、半歲及成年組牦牛免疫器官(脾臟、胸腺和淋巴結(jié))中的基因、蛋白水平及定位情況進(jìn)行分析。并用SPSS21.0軟件的單因素方差分析法對(duì)survivin和caspase-3基因及蛋白的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析。(4)采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western blot方法鑒定重組蛋白。將純化重組蛋白免疫健康成年大耳白兔制備多克隆抗體,用Western blot、間接ELISA技術(shù)及免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定多克隆抗體。結(jié)果 1.成功克隆了牦牛survivin編碼區(qū)基因(GenBank:KX121425.1),survivin基因編碼的蛋白質(zhì)含有103個(gè)氨基酸,分子量為11.8374 kDa,理論等電點(diǎn)為5.325pI,存在12個(gè)磷酸化位點(diǎn);且為可溶性,非跨膜蛋白;根據(jù)克隆基因序列預(yù)測(cè)出了survivin的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。以上結(jié)論說明,survivin在進(jìn)化中既具有高度保守性,也存在種屬特異性。2.Survivin在新生及成年組牦牛各組織器官中均有表達(dá),在相同器官中,survivin的表達(dá)水平成年組高于新生組。在相同年齡組中,survivin在牦牛心臟和肝臟中始終處于相對(duì)高水平表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,survivin陽性表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中。新生組survivin主要定位在心臟的心肌細(xì)胞,肝臟的肝細(xì)胞,脾臟的紅髓,肺臟的各級(jí)支氣管,腎臟的近端小管和遠(yuǎn)端小管(近端小管的陽性表達(dá)強(qiáng)于遠(yuǎn)端小管),大腦的神經(jīng)纖維及睪丸的肌樣細(xì)胞。與新生組相比,成年組的survivin陽性定位具有一定的差異性:成年組肺部survivin除了在各級(jí)支氣管有表達(dá),還在肺泡上皮細(xì)胞有表達(dá);成年組survivin主要定位在各級(jí)生精細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。3.在新生、半歲及成年組牦牛免疫器官中的表達(dá)結(jié)果顯示,相同年齡組,survivin在脾臟中的表達(dá)最高,胸腺次之,淋巴結(jié)最低,其中survivin基因在脾臟的表達(dá)水平和survivin蛋白在淋巴結(jié)表達(dá)水平分別呈極顯著差異(P0.01);相同器官,survivin的表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)呈下調(diào)趨勢(shì),且差異極顯著(P0.01)。而caspase-3的表達(dá)水平與survivin大致呈相反趨勢(shì)。此外,牦牛三個(gè)年齡組免疫器官中survivin和caspase-3的陽性定位一致,主要分布在淋巴結(jié)的髓質(zhì),胸腺的胸腺小體及脾臟的紅髓和邊緣區(qū)。4.成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE及Western blot分析鑒定,目的蛋白約為16.5 kDa,且以包涵體形式存在;純化蛋白經(jīng)Western blot分析鑒定,能與陽性血清特異性結(jié)合,說明具有較好的反應(yīng)原性;重組表達(dá)蛋白免疫大耳白兔后分離的血清經(jīng)Western blot分析能與重組蛋白特異性結(jié)合,說明重組蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體,具有較好的免疫原性。間接ELISA數(shù)據(jù)表明制備的多克隆抗體具有良好的抗體效價(jià)。制備的多克隆抗體能夠用于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。結(jié)論1.本文通過分析牦牛survivin編碼區(qū)核苷酸序列生物信息學(xué)特性,說明牦牛survivin基因在生物進(jìn)化過程中的高度保守性及種屬特異性。2.本文通過檢測(cè)survivin在新生和成年牦牛不同器官的表達(dá)和定位情況,說明survivin可能參與牦牛各組織器的功能調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步研究survivin對(duì)牦牛不同組織器官生理功能的調(diào)控機(jī)理提供重要的理論依據(jù)。3.本文通過檢測(cè)survivin和caspase-3在不同年齡牦牛免疫器官的表達(dá)和定位情況,說明survivin可能在caspase-3參與的凋亡通路上參與免疫器官適應(yīng)性以減緩牦牛免疫器官的衰老進(jìn)度。為進(jìn)一步研究survivin對(duì)牦牛機(jī)體免疫功能的調(diào)控機(jī)理提供重要的理論依據(jù)。4.本文通過構(gòu)建牦牛survivin重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,制備的兔源多克隆抗體能夠用于免疫組織化學(xué)、Western blot及間接ELISA試驗(yàn)。為牦牛機(jī)體其他因子抗體的制備奠定試驗(yàn)基礎(chǔ),也為以后開展牦牛survivin相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823.85;Q78
【圖文】：

結(jié)果表明牦牛與瘤牛和黃牛survivin基因的親緣關(guān)系最近，與人類survivin 基因的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（表 3 ）。利用軟件 MEGA6 中的臨位相連法（Neighbor-Joining）繪制出了survivin基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），系統(tǒng)進(jìn)化樹也表明牦牛survivin基因與瘤牛和黃牛的進(jìn)化水平較為相近，與人類的較遠(yuǎn)。表3 牦牛和其他物種之間survivin基因核苷酸序列同源性比較Table 3 Homologous comparisons of yak survivin gene with that of other species物種 GenBank序列號(hào) 核苷酸序列同源性（%）Species GenBank ID Nucleotide sequence homology（%）瘤牛（Bos indicus） XM_019982459.1 99黃牛（Bos taurus） NM_001001855.3 99綿羊（Ovis aries musimon） XM_012109576.2 98藏羚羊（Pantholops hodgsonii） XM_005958602.1 98山羊（Capra hircus） XM_005694094.3 96野豬（Sus scrofa） NM_214141.1 96馬（Equus caballus） XM_001915400.4 93犬（Canis lupus familiaris） NM_001003348.1 93雙峰駝（Camelus dromedarius） XM_010983810.1 92人（Homo sapiens） HM625836.1 90

2.1.3 牦牛 survivin 基因編碼蛋白親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析根據(jù)在線軟件Protscale分析牦牛survivin基因氨基酸序列的親疏水性結(jié)果表明（圖2）：survivin氨基酸序列第5位甘氨酸Gly預(yù)測(cè)的分值最高為1.500，其疏水性最強(qiáng)；第82位天冬酰胺Asn預(yù)測(cè)的分值最低為-3.322，其親水性最強(qiáng)。牦牛survivin基因編碼的整個(gè)氨基酸序列中親水性氨基酸大于疏水性氨基酸，表明survivin編碼蛋白為可溶性蛋白。根據(jù)在線軟件TMHMM Server V 2.0 分析發(fā)現(xiàn)survivin蛋白無跨膜螺旋，為非跨膜蛋白。

圖 3 牦牛survivin 氨基酸潛在磷酸化位點(diǎn)分析。臨界閾：紫色線條；絲氨酸：紅色線條；蘇氨酸：綠色線條；酪氨酸：藍(lán)色線條。當(dāng)線條高度超過臨界閾時(shí)代表該位點(diǎn)為潛在磷酸化位點(diǎn)。Figure 3 Potential phosphorylation site analyses of yak survivin. Threshold: purple lines;Serine: red lines; Threonine: green lines; Tyrosine: blue lines. If the line height exceeds thethreshold, it is the potential phosphorylation site.2.1.5 牦牛 survivin 基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別利用在線軟件IBCP和PHYRE2對(duì)survivin蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼survivin蛋白的103個(gè)氨基酸根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同分成了三部分，其中41個(gè)氨基酸構(gòu)成了該蛋白的α-螺旋區(qū)，占總蛋白的39.81%；20個(gè)氨基酸構(gòu)成了該蛋白的延伸鏈區(qū)，占總蛋白的19.42%；無規(guī)則卷曲由42個(gè)氨基酸組成，占總蛋白的40.77%。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 樊美榮;徐建軍;張o

本文編號(hào)：2749446