【摘要】：血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的,嚴重危害人畜健康和經(jīng)濟發(fā)展的重大寄生蟲病,至今仍是一個需要重視的公共衛(wèi)生問題。日本血吸蟲成熟雌蟲所產(chǎn)蟲卵是造成宿主病理損害及疾病再傳播的根源,因此從控制雌蟲生殖發(fā)育入手對控制血吸蟲病的發(fā)生具有重要意義。本研究采用RT-PCR技術(shù)擴增SjELAV-like 2基因,將其克隆到原核表達載體pET-28a,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28(+)/SjELAV-like2,重組蛋白經(jīng)純化后制備了相應的多克隆抗體。結(jié)果表明,該基因長度為1894bp(登錄號:MG515726),開放閱讀框長度為1 635bp,共編碼544個氨基酸,合并His-tag后分子量為64.2 kDa,與預期結(jié)果相符;Western blotting結(jié)果表明該蛋白具有良好的反應原性。熒光實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn),該基因在血吸蟲童蟲時期高表達,成熟后趨于穩(wěn)定,且在雌蟲體內(nèi)的表達量顯著高于同時期合抱雄蟲:該基因在合抱后不同時期雄蟲體內(nèi)的表達量基本恒定,但正常合抱雄蟲該基因的表達極顯著高于單性感染雄蟲。免疫組化研究發(fā)現(xiàn),該蛋白主要定位于血吸蟲蟲體體被。通過體內(nèi)RNAi實驗成功篩選出干擾效果最佳的S1 dsRNA,并使用S1 dsRNA進行體內(nèi)長期干擾試驗。Real time RT-PCR結(jié)果顯示,RNA干擾可明顯抑制SjELAV-like2基因的表達。對長期干擾蟲體產(chǎn)卵及卵胚孵化進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,受干擾組宿主每克肝臟荷卵減少達46.02%(P0.01),蟲卵的卵胚孵化減少達75.79%(P0.01),說明SjELAV-like 2基因?qū)ρx產(chǎn)卵及蟲卵孵化有重要影響。利用掃描電鏡觀察干擾組蟲體及NC組蟲體的體被表膜變化情況發(fā)現(xiàn),SjELAV-like2siRNA干擾組蟲體體被結(jié)構(gòu)有明顯改變,體被上泡狀突出物明顯增多。綜上所述,本研究首次成功克隆、表達了SjELAV-like 2基因,分析了該基因在日本血吸蟲不同時期、不同狀態(tài)的表達情況,并通過RNAi實驗初步研究了該基因沉默對血吸蟲生長發(fā)育的影響,為今后進一步研究該基因?qū)ρx雌蟲生殖發(fā)育的影響及血吸蟲疫苗候選分子的篩選奠定了基礎。
【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.735
【圖文】：

３Ａ邋ＳｊＥＬＡＶ－�。椋В耄邋澹插寤虻拿�？查逡逑以曰本血吸蟲成蟲ｃＤＮＡ為模板，成功克隆出沒如２基因完整ＯＲＦ逡逑序列（圖１－１）逡逑ｂｐ邐Ｍ邋１邐２逡逑２０００邋￣逡逑１０００邋—Ｉ逡逑７５０邋—Ｐ逡逑５００——Ｂ逡逑２５０邋—Ｉ逡逑１００邋——■逡逑圖１－１邋？ＳｊｆＴＵＫ－Ｍｅ邋２的ＰＣＲ擴增產(chǎn)物逡逑－１７－逡逑

轉(zhuǎn)移至ＮＣ膜上，用小鼠抗ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２蛋白的特異性血清作為一抗，Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三條條帶，將它們對應位置的蛋白進行質(zhì)譜檢測，結(jié)逡逑果表明僅特異性條帶位置含有目的蛋白（圖１－４），出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是由于制備逡逑特異性血清的ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２蛋白抗原由切膠法純化而來，其中可能含有某些可逡逑刺激產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果表明ＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２具有良好的反應逡逑原性。逡逑－１９－逡逑

——■■■■■■■Ｉ逡逑圖１－４小鼠抗ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２多抗與全蟲蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析逡逑Ｍ：蛋白標準分子量；１：日本血吸蟲全蟲蛋白２：空白逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ａｎｔｉ－ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２邋ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑Ｍ：邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｍａｓｓ邋ｍａｒｋｅｒ；邋ｌａｎｅ邋１邋：邋ｓｏｌｕｂｌｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ邋ｊａｐｏｎｉｃｕｍ邋２邋：邋ｂｌａｎｋ逡逑３．４不同時期血吸蟲基因的擴增逡逑以１８、２５、２８、３５、４２ｄ日本血吸蟲ｃＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴增沒ＡＬＡＷ／知逡逑２基因，電泳結(jié)果顯示不同時期ｃＤＮＡ擴增產(chǎn)物大小相同（圖１－５），將ＰＣＲ產(chǎn)逡逑物連接到Ｔ－克隆載體，對陽性克隆的測序分析也說明不同時期ｃＤＮＡ擴增的逡逑沒２基因產(chǎn)物相同，表明該基因在血吸蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄時剪切方式一致。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５逡逑２０００——■逡逑１０００——■逡逑７５０——Ｉ逡逑５００——■逡逑２５０——Ｉ逡逑１００——■逡逑圖１－５不同時期血吸蟲沒２基因的ＰＣＲ擴增逡逑－２０－逡逑

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