【摘要】：二十碳五烯酸(EPA)是一種ω-3多不飽和脂肪酸,具有抗炎、抗癌、抗凝血、降血脂、防心血管疾病等多種生理功能。然而,EPA主要來(lái)源于深海魚(yú)油,由于魚(yú)類資源的有限、海洋環(huán)境的污染與提取工藝的復(fù)雜性,尋找可持續(xù)發(fā)展的EPA替代來(lái)源成為研究熱點(diǎn)。其中,微生物油脂受到廣泛關(guān)注并研究。產(chǎn)油微生物高山被孢霉油脂含量高、多不飽和脂肪酸(PUFAs)種類豐富,是經(jīng)過(guò)FDA安全認(rèn)證的用于生產(chǎn)花生四烯酸的工業(yè)化菌株。課題組前期通過(guò)過(guò)表達(dá)ω-3脂肪酸脫飽和酶PPD17獲得重組菌株高山被孢霉CCFM698,實(shí)現(xiàn)了常溫下將ARA轉(zhuǎn)化為EPA的突破。為了進(jìn)一步提高菌株的生產(chǎn)能力,本文進(jìn)行了一系列的發(fā)酵工藝優(yōu)化,并提出了一種基于溶氧與兩階段pH調(diào)控高山被孢霉高產(chǎn)EPA的補(bǔ)料發(fā)酵工藝。最后,將高山被孢霉作為PUFAs飼料添加劑應(yīng)用于蛋雞飼料中,考察其對(duì)雞蛋與蛋雞組織PUFAs組分的影響。主要研究結(jié)果如下:1.在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上,確定了分批發(fā)酵的最適碳氮源添加比例為50 g/L葡萄糖與20 g/L豆粕。在7.5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中,分別針對(duì)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速、富氧介質(zhì)以及富氧空氣等影響發(fā)酵體系溶氧的因素進(jìn)行了考察。研究結(jié)果表明,發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)可以防止剪應(yīng)力過(guò)大對(duì)高山被孢霉菌體造成損傷,然而該轉(zhuǎn)速條件無(wú)法滿足菌體生長(zhǎng)與脂質(zhì)積累過(guò)程中的高溶氧需求。因此進(jìn)一步對(duì)溶氧供給進(jìn)行了研究,結(jié)果表明添加富氧介質(zhì)4%正己烷可以提高發(fā)酵體系的溶氧,但正己烷不利于菌體生長(zhǎng)與EPA的積累;而采用富氧空氣策略維持發(fā)酵體系相對(duì)溶氧在30%左右可以有效滿足溶氧需求,且EPA產(chǎn)量相比優(yōu)化前提高了1.8倍。因此選擇富氧空氣策略作為發(fā)酵過(guò)程中的溶氧調(diào)控措施。2.由于富氧空氣策略下糖耗速率劇增,分批發(fā)酵后期葡萄糖供應(yīng)不足阻礙了脂質(zhì)的合成與積累,因此進(jìn)行了補(bǔ)料工藝研究。補(bǔ)料工藝研究結(jié)果表明,殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料控制初始葡萄糖含量為30 g/L,通過(guò)間歇性補(bǔ)料維持殘?zhí)菨舛仍?0~30 g/L,使得EPA的產(chǎn)量提高了79.1%。不同pH控制策略研究結(jié)果表明,氨水流加法能有效提高高山被孢霉的生物量和產(chǎn)脂水平,且高山被孢霉菌體生長(zhǎng)的最適pH為6.0,脂質(zhì)積累的最適pH為6.5。綜上研究提出一種基于溶氧與兩階段pH調(diào)控高山被孢霉高產(chǎn)EPA的補(bǔ)料發(fā)酵工藝,最終菌體生物量可達(dá)41.2 g/L,總脂占菌干重31.6%,EPA產(chǎn)量高達(dá)3.5 g/L,該EPA產(chǎn)量為目前在高山被孢霉中的最高產(chǎn)量。3.通過(guò)蛋雞實(shí)驗(yàn)研究高山被孢霉作為PUFAs飼料添加劑對(duì)雞蛋與蛋雞組織PUFAs組分的影響。研究結(jié)果表明隨著高山被孢霉添加比例的增加,雞蛋中的ARA、DPA與DHA含量逐步增加,ω-6/ω-3 PUFAs的比值逐漸下降,其中添加2%高山被孢霉在補(bǔ)充期末期時(shí)雞蛋中的ARA、DPA與DHA含量分別提高21.1%、67.9%與68.9%,ω-6/ω-3PUFAs比值下降28.6%。另外,添加高山被孢霉可以顯著降低蛋雞組織的ω-6/ω-3 PUFAs的比值。其中添加2%高山被孢霉在補(bǔ)充期末期時(shí)雞肝、雞血、雞胸肉中ω-6/ω-3 PUFAs比值分別下降46.5%、61.4%與73.7%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ920.6;TQ645.6;S816
【圖文】：

3 結(jié)果與討論知 400 r/min 條件下的相對(duì)溶氧在第 48 h 已降為 0，說(shuō)明溶氧供給滿足不了溶氧需求。與此相比 500 r/min 條件溶氧雖然略高一點(diǎn)，但是 500 r/min 轉(zhuǎn)速過(guò)高造成剪應(yīng)力損傷并在罐內(nèi)中心產(chǎn)生旋渦，影響發(fā)酵液的均一性，且產(chǎn)生大量的泡沫容易導(dǎo)致染菌和溢罐因此，從成本上及實(shí)驗(yàn)控制等方面綜合考慮適宜的轉(zhuǎn)速條件為 400 r/min。Peng 等[49]在7.5L 發(fā)酵罐中研究分階段轉(zhuǎn)速控制對(duì)高山被孢霉 ME-1 產(chǎn) ARA 的影響，在 0~96h 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為 180 r/min，后切換為 100 r/min，最終相比轉(zhuǎn)速一直為 180 r/min 條件 ARA 產(chǎn)量增加了 50.3%，結(jié)果說(shuō)明高山被孢霉對(duì)剪應(yīng)力的敏感性，脂質(zhì)積累期可以通過(guò)降低轉(zhuǎn)速來(lái)減少剪應(yīng)力對(duì)菌體造成的損傷，從而促進(jìn)脂質(zhì)的合成。由于 400 r/min 不能滿足整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的高溶氧需求，溶氧不足會(huì)阻礙菌體的生長(zhǎng)及脂質(zhì)的積累，因此有必要采取進(jìn)一步的措施進(jìn)行溶氧供給。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文過(guò)程中提高溶氧最為常用的策略之一，但是由于絲狀真菌對(duì)剪切力敏感，高轉(zhuǎn)速對(duì)菌體造成損傷因此轉(zhuǎn)速需要控制在適宜的范圍內(nèi)。在適宜轉(zhuǎn)速條件下，通過(guò)在發(fā)酵體系中加入富氧介質(zhì)增加發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧系數(shù)或者通過(guò)通入富氧空氣來(lái)提高溶氧供應(yīng)是緩解微生物高氧需求的兩種重要策略[54]。本研究利用重組菌株高山被孢霉 CCFM698 在常溫下發(fā)酵生產(chǎn) EPA，通過(guò)分批發(fā)酵優(yōu)化選擇出適宜的轉(zhuǎn)速，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究添加 4正己烷與通入富氧空氣的溶氧供給策略對(duì)發(fā)酵的影響，其中通入富氧空氣策略維持體系相對(duì)溶氧在 30%左右可以緩解發(fā)酵過(guò)程中高溶氧需求的問(wèn)題，且大幅度提高了高山被孢霉產(chǎn) EPA 的能力，可以作為一種溶氧供給策略應(yīng)用于絲狀真菌高密度發(fā)酵過(guò)程。3.1.3.1 添加富氧載體 4%正己烷策略對(duì)高山被孢霉產(chǎn) EPA 的影響研究由于在適宜的轉(zhuǎn)速 400 r/min 條件下仍無(wú)法滿足發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)以及脂質(zhì)積累過(guò)程中的高溶氧需求，需要采取進(jìn)一步的溶氧供給措施。該部分實(shí)驗(yàn)研究添加富氧載體4%正己烷策略對(duì)提高發(fā)酵體系的溶氧與產(chǎn)物積累的影響，其發(fā)酵檢測(cè)數(shù)據(jù)如圖 3-2 所示。

22圖 3-3 通入富氧空氣策略對(duì)發(fā)酵過(guò)程中溶氧%(a)，生物量(b)，總脂(c)、EPA 產(chǎn)量(d)與殘?zhí)菨舛?e)的影響Fig 3-3. The effects of dding oxygen-enriched air strategy on DO% (a), DCW (b), TFA (c), EPAproduction (d) and residual glucose concentration (e) during the fermentation process

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本文編號(hào)：2749211