【摘要】：畢氏微孢子蟲(Enterocytozoon bieneusi),芽囊原蟲(Blastocystis spp.)和隱孢子蟲(Cryptosporidium)是三種常見的人獸共患寄生性原蟲。該些病原主要通過糞口途徑傳播,嚴重威脅動物與人類的健康。盡管國內(nèi)關于畢氏微孢子蟲,芽囊原蟲和隱孢子蟲的調(diào)查報道很多,但很少有關于黑熊感染這三種寄生蟲的報道。為了明確黑龍江省家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲,芽囊原蟲和隱孢子蟲的流行情況與基因型分布情況。本研究共采集312頭黑熊的糞便樣品,提取糞便基因組,通過擴增ITS,SSU r RNA和18S SSU r RNA基因序列確定黑龍江省家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲,芽囊原蟲和隱孢子蟲感染情況,并鑒別畢氏微孢子蟲和芽囊原蟲的基因型。采用巢式PCR技術(shù)對黑龍江省家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲的流行率及蟲種/基因型和亞型進行鑒定,結(jié)果表明:黑龍江省家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲感染率為4.8%(15/312;95%CI2.4-7.2)。雌性黑熊畢氏微孢子蟲感染率為6.6%(9/136;95%CI 2.4-10.8),雄性黑熊畢氏微孢子蟲感染率為3.4%(6/176;95%CI 0.7-6.1),雌性黑熊畢氏微孢子蟲感染率高于雄性黑熊。幼年黑熊畢氏微孢子蟲感染率為5.6%(10/180;95%CI 2.2-8.9),成年黑熊畢氏微孢子蟲感染率為3.8%(5/132;95%CI 0.5-7.1),幼年黑熊畢氏微孢子蟲感染率高于成年黑熊。室外飼養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲感染率為10.5%(6/57;95%CI 2.3-18.7),室內(nèi)飼養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲感染率為3.5%(9/255;95%CI 1.2-5.8),室外黑熊畢氏微孢子蟲感染率高于室內(nèi)黑熊。用統(tǒng)計學軟件(SPSS 16.0)對畢氏微孢子蟲進行了風險因素的分析。在單個因素分析中,通過計算比值比(OR,odds ratio)及其95%CI(confidence interval),發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)位置(室外;P=0.033,P0.05;OR:3.216)會增大黑熊患畢氏微孢子蟲病風險的可能。通過畢氏微孢子蟲核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)的序列分析,從15個畢氏微孢子蟲PCR陽性樣本中鑒定出6個新基因型(CHB-1,CHB-2,CHB-3,CHB-4,CHB-5和CHB-6)。通過ITS序列的系統(tǒng)進化分析顯示,本研究鑒定出的6個新基因型均位于具有人獸共患可能性的進化組Group 1中。本研究還應用多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技術(shù)對所鑒定出的家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲陽性DNA樣本進行基因亞型鑒定。結(jié)果顯示,共12個ITS基因型的分離株在2個位點(2個微衛(wèi)星位點:MS3和MS7)測序成功,共檢測出5種新的多位點基因型(MLG novel1-5),顯示出黑熊源畢氏微孢子蟲的遺傳多樣性。該研究結(jié)果表明ITS序列分析能力不足,而MLST分型方法可以彌補這個點。我們可以應用MLST分型方法來評估畢氏微孢子蟲蟲株人獸共患的可能性以及其傳播途徑播等問題。采用PCR技術(shù)對黑龍江家養(yǎng)黑熊芽囊原蟲的流行率及蟲種/基因型和亞型進行鑒定,結(jié)果表明:黑龍江家養(yǎng)黑熊芽囊原蟲感染率為14.4%(45/312;95%CI 2.0-26.8)。雌性黑熊芽囊原蟲的感染率為16.2%(22/136;95%CI 9.9-22.4),雄性黑熊芽囊原蟲感染率為13.1%(23/176;95%CI 8.0-18.1),雌性黑熊芽囊原蟲的感染率高于雄性黑熊。幼年黑熊芽囊原蟲感染率為18.3%(33/180;95%CI 12.6-24.0),成年黑熊芽囊原蟲感染率為9.1(12/132;95%CI 4.1-14.1),幼年黑熊芽囊原蟲感染率高于成年黑熊。室外飼養(yǎng)黑熊芽囊原蟲感染率為24.6(14/57;95%CI 13.6-37.3),室內(nèi)黑熊芽囊原蟲的感染率為12.2%(31/255;95%CI 8.1-16.2),室外黑熊芽囊原蟲感染率高于室內(nèi)黑熊。用統(tǒng)計學軟件(SPSS 16.0)對芽囊原蟲進行了風險因素的分析。在單個因素分析中,通過計算比值比(OR,odds ratio)及其95%CI(confidence interval),發(fā)現(xiàn)年齡(幼年,P=0.024;P0.05;OR:2.245)與飼養(yǎng)位置(室外;P=0.018,P0.05;OR:2.353)會增大黑熊患芽囊原蟲病風險的可能。通過芽囊原蟲SSU r RNA基因的序列分析證明,在45個PCR陽性樣本中,共鑒定出一個基因型ST 1,通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)該基因型存在人畜共患可能性。采用巢式PCR技術(shù)對黑龍江家養(yǎng)黑熊隱孢子蟲的流行率及蟲種/基因型和亞型進行鑒定。結(jié)果表明:黑龍江家養(yǎng)黑熊隱孢子蟲感染率為0%(0/312)。綜上所述,本研究首次對黑龍江地區(qū)家養(yǎng)黑熊三類腸道原蟲進行調(diào)查,明確了黑龍江地區(qū)家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲,芽囊原蟲和隱孢子蟲感染率,基因型或亞型及人獸共患風險性。運用更精確的MLST分型方法對我國黑龍江地區(qū)家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲進行多位點序列分型,獲得了畢氏微孢子蟲的遺傳學信息。研究結(jié)果為防控畢氏微孢子蟲,芽囊原蟲和隱孢子蟲提供基礎數(shù)據(jù)。
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.93
【圖文】：

本研究基于核糖體RNA基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的序列分析，對我國黑龍江地區(qū)所采集的312份黑熊糞便樣本進行PCR擴增以鑒定畢氏微孢子基因型，鑒定結(jié)果見表3-1和圖3-1，部分PCR陽性結(jié)果電泳圖見圖3-2。表3-1 黑龍江省家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲的患病率Table 3-1 The prevalence of E. bieneusi in farmed black bear in Heilongjiang Province因素 分類 樣品數(shù) 陽性數(shù) 感染率 95%置信區(qū)間 OR值 P值性別雄 176 6 3.4% 0.7-6.1 Reference 0.287雌 136 9 6.6% 2.4-10.8 1.776年齡幼年 180 10 5.6% 2.2-8.9 1.494 0.473成年 132 5 3.8% 0.5-7.1 Reference飼養(yǎng)位置室內(nèi) 255 9 3.5% 1.2-5.8 Reference 0.033室外 57 6 10.5% 2.3-18.7 3.216圖3-1 不同性別、年齡和位置的畢氏微孢子蟲感染率（%）情況Fig. 3-1 The prevalence of the E. bieneusi in different region,gander and age.

201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M圖3-2 巢式PCR擴增畢氏微孢子蟲結(jié)果Fig. 3-2 The nested-PCR products of E. bieneusi1：陽性對照；2-9：樣本；10：陰性對照；M：marker1：positive control；2-9：sample；10：Negative control；M：marker由表3-1可以看出，黑龍江家養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲感染率為4.8%（15/312；95% CI2.4-7.2）。雌性黑熊畢氏微孢子蟲感染率為6.6%（9/136；95% CI 2.4-10.8），雄性黑熊畢氏微孢子蟲感染率為3.4%（6/176；95% CI 0.7-6.1），雌性黑熊畢氏微孢子蟲感染率高于雄性黑熊。幼年黑熊畢氏微孢子蟲感染率為5.6%（10/180；95% CI 2.2-8.9），成年黑熊畢氏微孢子蟲感染率為3.8%（5/132；95% CI 0.5-7.1），幼年黑熊畢氏微孢子蟲感染率高于成年黑熊。室外飼養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲感染率為10.5%（6/57；95% CI 2.3-18.7），室內(nèi)飼養(yǎng)黑熊畢氏微孢子蟲感染率為3.5%（9/255；95% CI 1.2-5.8），室外黑熊畢氏微孢子蟲感染率高于室內(nèi)黑熊。對家養(yǎng)黑熊的感染因素進行了二邏輯回歸分析

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本文編號：2747707