【摘要】：單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),是一種食源性致病菌,在自然界中廣泛存在,常通過污染的食物感染人和動(dòng)物。該菌為胞內(nèi)寄生菌,可穿越宿主血腦屏障,腸道屏障及胎盤屏障,臨床上引起腹瀉、腦膜腦炎、敗血癥、新生兒溶血、肝炎及流產(chǎn)等癥狀,發(fā)病率及死亡率較高。LM細(xì)胞壁表面存在多種毒力蛋白,其中有一類至關(guān)重要的表面蛋白,其C-末端區(qū)含有LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly)保守基序,由分選酶Sort A識(shí)別共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁肽聚糖上,呈現(xiàn)在細(xì)胞表面,發(fā)揮其毒力作用。根據(jù)LM EGD-e參考菌株的全基因組序列預(yù)測(cè)有41種LPXTG基序蛋白,其中Lmo0159和Lmo0160功能未知,本研究以李斯特菌病綿羊腦分離株LM90SB2為研究對(duì)象,對(duì)lmo0159、lmo0160基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析;利用同源重組技術(shù)分別構(gòu)建LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160基因缺失株,分析其在環(huán)境耐受性、生物被膜形成能力及細(xì)胞水平和動(dòng)物機(jī)體毒力的差異,以探討lmo0159和lmo0160基因的功能,為進(jìn)一步研究LM的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因克隆及序列分析:為了了解LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因編碼蛋白的特征,利用PCR方法擴(kuò)增lmo0159、lmo0160基因,分別連接pMD19-T載體,測(cè)序分析其特征。結(jié)果顯示:lmo0159序列全長(zhǎng)2 070bp,編碼617個(gè)氨基酸;lmo0160序列全長(zhǎng)為1 708bp,編碼475個(gè)氨基酸;lmo0159、lmo0160基因核苷酸序列分別與不同來源4b型LM同源性均高達(dá)99%以上。Lmo0159蛋白是一種偏酸性、穩(wěn)定、親水性蛋白;Lmo0160蛋白為疏水性蛋白。兩種蛋白均含有膠原蛋白結(jié)合域和Cna B功能域。本研究成功克隆LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因,并初步預(yù)測(cè)分析了目的基因部分生物學(xué)特征,為進(jìn)一步研究LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因功能提供了理論依據(jù)。2.LM90SB2-(35)lmo0159、LM90SB2-(35)lmo0160缺失株的構(gòu)建及鑒定:為研究lmo0159、lmo0160基因的功能,本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增lmo0159、lmo0160基因的上下游同源臂,SOE-PCR方法進(jìn)行同源臂融合,獲得(35)lmo0159、(35)lmo0160缺失片段,分別連接到pMD19-T載體,獲得pMD19-T-(35)lmo0159、pMD19-T-(35)lmo0160,測(cè)序成功后,經(jīng)雙酶切并連接至pKSV7,獲得重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-(35)lmo0159和pKSV7-(35)lmo0160,分別電轉(zhuǎn)化到LM90SB2感受態(tài)細(xì)胞中,獲得陽性轉(zhuǎn)化子,置于含10μg/m L氯霉素BHI培養(yǎng)基中,42℃?zhèn)鞔囵B(yǎng),獲得LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160基因缺失株。再置37℃無抗性BHI培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)30代,PCR檢測(cè)遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果顯示LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160基因缺失株構(gòu)建成功,且遺傳穩(wěn)定。3.LM90SB2-(35)lmo0159、LM90SB2-(35)lmo0160缺失株環(huán)境適應(yīng)性和生物被膜形成能力的研究:為探討lmo0159和lmo0160基因缺失對(duì)LM環(huán)境適應(yīng)性和生物被膜形成能力的影響。本試驗(yàn)測(cè)定了不同溫度、pH、NaCl、乙醇脅迫環(huán)境下細(xì)菌生長(zhǎng)情況及生物被膜形成能力。結(jié)果顯示:在37℃和42℃培養(yǎng)條件下,LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160的生長(zhǎng)低于LM90SB2;在0.5%和2.5%NaCl BHI中,LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160的生長(zhǎng)低于LM90SB2;在3%和3.5%乙醇BHI中,LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160的生長(zhǎng)低于LM90SB2;顯微鏡觀察LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160形成生物被膜的交聯(lián)密集度均低于LM90SB2;生物被膜定量分析發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),OD_(570)70 nm差異也增大,尤其在48h,差異均為極極顯著(P?0.001)。結(jié)果表明,lmo0159和lmo0160基因的缺失降低了LM90SB2對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和生物被膜形成能力。4.LM90SB2-(35)lmo0159、LM90SB2-(35)lmo0160缺失株毒力的研究:為探討lmo0159和lmo0160基因缺失對(duì)LM毒力的影響。本試驗(yàn)分別用親本株和缺失株對(duì)MBMEC、RAW264.7、SIEC和HBMEC細(xì)胞進(jìn)行粘附、侵襲及細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn),及對(duì)小鼠腹腔感染后測(cè)定肝、脾、腦載菌量及小鼠存活時(shí)間。結(jié)果顯示:LM90SB2-(35)lmo0159較LM90SB2,對(duì)SIEC及RAW264.7細(xì)胞的粘附率、侵襲率均降低,差異極顯著(P?0.01);LM90SB2-(35)lmo0160較LM90SB2,對(duì)RAW264.7細(xì)胞的粘附率、侵襲率均降低,分別為差異極顯著(P?0.01)與差異顯著(P?0.05);缺失株對(duì)MBMEC、SIEC及HBMEC的胞內(nèi)增殖量均降低;缺失株小鼠存活時(shí)間較親本株均顯著延長(zhǎng)(P0.05);LM90SB2-?lmo0159和LM90SB2-?lmo0160對(duì)小鼠LD_(50)較LM90SB2分別下降了0.97和0.86個(gè)數(shù)量級(jí);缺失株較親本株,在肝和脾中的載菌量均降低。試驗(yàn)結(jié)果表明lmo0159和lmo0160基因缺失后均降低了LM90SB2的毒力。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

單增李斯特菌表面蛋白基因 lmo0159、lmo0160 缺失株的構(gòu)建及部分生物學(xué)特性研究果目的基因的擴(kuò)增與克隆用特異性引物分別擴(kuò)增 lmo0159 和 lmo0160 基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L 瓊脂糖檢測(cè)，lmo0159 基因和 lmo0160 基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別在約 2 070 bp 和 1 708 bp 處帶，與預(yù)期片段大小一致（圖 1-2）。經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后，驗(yàn)證為陽性菌的質(zhì)粒提海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，成功獲得序列長(zhǎng)為 2 lmo0159 基因陽性轉(zhuǎn)化子和序列長(zhǎng)為 1 708 bp 的 lmo0160 基因陽性轉(zhuǎn)化子。

單增李斯特菌表面蛋白基因 lmo0159、lmo0160 缺失株的構(gòu)建及部分生物學(xué)特性研究果目的基因的擴(kuò)增與克隆用特異性引物分別擴(kuò)增 lmo0159 和 lmo0160 基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L 瓊脂糖檢測(cè)，lmo0159 基因和 lmo0160 基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別在約 2 070 bp 和 1 708 bp 處帶，與預(yù)期片段大小一致（圖 1-2）。經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后，驗(yàn)證為陽性菌的質(zhì)粒提海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，成功獲得序列長(zhǎng)為 2 lmo0159 基因陽性轉(zhuǎn)化子和序列長(zhǎng)為 1 708 bp 的 lmo0160 基因陽性轉(zhuǎn)化子。

圖 1-3 不同菌株 lmo0159 基因核苷酸和氨基酸序列與參考菌株同源性比對(duì)分析Fig.1-3 Homology analysis of nucleotide and amino acid sequences of lmo0159gene in various strains注: 右上角表示 lmo0159 基因核苷酸同源性, 左下角表示 Lmo0159 氨基酸同源性。Note: The right corner of lmo0159 nucleotide homology and the left corner of Lmo0159 amino acid homology.應(yīng)用 MEGA 6.0 分析軟件，繪制 lmo0159 基因編碼序列進(jìn)化樹。LM90SB2 菌株lmo0159 基因序列與 4b 血清型菌株聚為同一支，之后與 4a 血清型菌株形成一大類群，說明它們親緣關(guān)系比較近，而和 1/2a 血清型菌株形成另一個(gè)分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1-4）。其遺傳進(jìn)化樹與同源性分析相一致。

【參考文獻(xiàn)】

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4 張?jiān)俪?喬軍;蔡擴(kuò)軍;陳創(chuàng)夫;孟慶玲;李R

本文編號(hào)：2747669