【摘要】：奶牛結核病(Bovine tuberculosis,TB)和布魯氏菌病(Bovine brucellosis)嚴重威脅著我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展和人類公共衛(wèi)生安全。2012年,國務院辦公廳印發(fā)了《國家動物疫病防治中長期規(guī)劃(2012-2020)》,將奶牛結核病和布魯氏菌病列為二類動物疫病,且制定了奶牛結核病和布魯氏菌病的綜合防治措施。本研究根據《2017年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調查計劃》(農醫(yī)發(fā)[2017]7號)、《全國動物疫病專項流行病學調查實施方案》(農醫(yī)防便函[2016]322號)、《國家奶牛結核病防治指導意見(2017-2020)》(農醫(yī)發(fā)[2017]20號)和《國家布魯氏菌病防治計劃(2016-2020)》(農醫(yī)發(fā)[2016]38號)規(guī)定的奶牛結核病和布魯氏菌病調查方案,對貴州地區(qū)奶牛結核病和布魯氏桿菌病感染情況展開調查,初步掌握了貴州省奶牛結核病和布魯氏菌病感染情況;并建立快速、準確、可靠的牛結核病和布魯氏菌病的二重PCR診斷方法;通過對牛奶營養(yǎng)安全和衛(wèi)生安全的研究分析,并參照國家相關標準和規(guī)定,確定了安全評價體系的檢測項目及指標,并建立可實施的安全性評價體系。以期為貴州省奶牛養(yǎng)殖,牛奶安全保障提供參考。1貴州省奶牛結核病和布魯氏菌病感染情況調查為了解貴州省奶牛結核病的感染流行情況,2017-2018年間試驗隨機抽取貴州省9個州市的規(guī)�；膛ｐB(yǎng)殖場共106場次,兩年間采集抗凝血液樣品20 478份進行牛結核γ-干擾素ELISA試驗檢測,檢出陽性樣品10份,個體陽性率為0.05%(10/20 478),其中2017年檢出陽性樣品7份,個體陽性率為0.07%(7/10 306),2018年檢出陽性樣品3份,個體陽性率0.03%(3/10 172)�？梢�,2018年較2017年陽性率有所下降;為調查布魯氏菌病感染情況,2017-2018年間試驗隨機采集了全省9個州市的共106場次的奶牛全血樣品27 435份,其中檢出陽性樣品6份,陽性率為0.02%(6/27 435),2017-2018年同一個場群連續(xù)檢出陽性,2017年陽性群體為4個,2018年下降到了2個。調查結果表明,近年來貴州省關于奶牛結核病和布病的防控防疫措施收到一定成效,兩種傳染病的感染率呈下降趨勢。2奶牛結核病和布魯氏菌病二重PCR診斷方法的建立及應用參照NCBI中牛結核分枝桿菌pnc A(AF212297))、布魯氏桿菌BM 21(AL27674)等基因序列,應用相關軟件各設計了1對特異性引物,分別用于擴增牛結核分枝桿菌pnc A基因、布魯氏桿菌BM 21基因的部分序列,擴增的目的片段大小為416 bp和282bp。用合作單位提供的陽性病料,通過對2種細菌單一PCR的退火溫度和敏感性進行優(yōu)化和檢測,得到最佳退火溫度分別為:牛結核分枝桿菌57℃、布魯氏桿菌59℃,由敏感性得出最低檢測量分別是:牛結核分枝桿菌68 pg、布魯氏桿菌43 pg。再選擇合適的二重PCR緩沖體系及酶,優(yōu)化退火溫度、模板及引物濃度,得出最佳反應體系為25μL,最佳退火溫度為59℃;最后摸索二重PCR的特異性、敏感性,結果二重PCR中兩種細菌的最低檢測量分別為牛結核分枝桿菌68 pg、布魯氏桿菌43 pg,證明試驗建立的二重PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強等特點,本試驗成功建立了一種能夠同時且快速檢測牛結核病和布魯氏桿菌病的二重PCR檢測方法。應用所建立的牛結核病和布魯氏菌病二重PCR檢測方法對2017-2019年4月間貴州部分地區(qū)的246份病料進行檢測,二重PCR檢測結果表明:246份病料中檢出牛結核陽性1份,感染率為0.4%(1/246);檢出布病陽性2份,感染率為0.81%(2/246);牛結核和布魯氏菌病混合感染1份,混合感染率為0.4%(1/246);二重PCR與單一PCR的符合率均為100%。由此可見,奶牛結核病和布魯氏菌病在貴州省牛群中存在且有混合感染的情況,試驗建立的二重PCR檢測方法對奶牛場單一或混合感染的快速診斷具有十分重要的意義。3牛奶安全性評價體系的建立及推廣應用為確保牛奶的安全,本試驗通過對貴州省奶牛養(yǎng)殖情況的調查,牛奶營養(yǎng)安全和衛(wèi)生安全的分析及探討,確定了本實驗安全性評價體系需檢測牛奶中是否含有牛結核分枝桿菌、布魯氏桿菌;牛奶乳蛋白含量是否達標;鉛、汞、磺胺類、氯霉素、三聚氰胺、黃曲霉素的含量是否超標。并參照國家和國際相關標準和規(guī)定,確定安全性評價體系所測項目的指標為:不得檢出牛結核分枝桿菌和布魯氏桿菌;不得檢出氯霉素和三聚氰胺;乳蛋白含量不得低于2.8 g/100 g、鉛含量不得高于0.05 mg/kg、汞含量不得高于0.01mg/kg、磺胺類殘留不得超過0.10 mg/kg、黃曲霉素M1不得超過0.5 ug/kg,并建立可實施的評價體系。該方案首先采用本實驗已建立的二重PCR檢測方法檢測牛結核和布病,再進行后續(xù)項目檢測。為驗證方案的可行性和實用性,本實驗于2017-2019年4月間,從貴州省不同養(yǎng)殖場采集牛奶樣品共2 123份,進行牛結核病和布病以及重金屬鉛、汞含量、磺胺類殘留、三聚氰胺、黃曲霉素M1、氯霉素含量等檢測,未檢出鉛、氯霉素、三聚氰胺不合格奶樣,檢出牛結核和布病不合格樣品4份,乳蛋白含量不合格17份、磺胺類含量超標26份,黃曲霉素M1超標11份,將檢測數據加以統(tǒng)計分析,得出針對貴州牛奶安全的建議指標。結果表明該安全性評價方案可以推廣實施。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23
【圖文】：

圖 2.1 虎紅平板凝集試驗Figure 2.1 Tiger red plate agglutination testSAT) 1:50、1:100、1:200、1:400，4 個稀釋度，釋度，本實驗選用的稀釋度為 1:50 和 1:100釋到 1:50 和 1:100，抗原作 20 稀釋并加入℃溫箱 22-24 h 后，取出檢查并記錄結果。陽性血清和抗原對照:、陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血釋到原有滴度，家抗原的方法與受檢血清相

圖 3.1 樣品來源及采集Figure 3.1 Sample Source and AcquisitionEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver19-T Vector等均購自大連寶生物工程有限公司（ Kit 試劑盒和E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit 質iowest 公司產品；乙醇等為國產分析純試劑。器與耗材儀、Thermo Forma -80℃超低溫冰箱和 Gel DOC公司；

NA模板 4.0 μLTaq酶 1.0 μL體積 25.0 μL應條件的優(yōu)化應的退火溫度（55-60℃）進行優(yōu)化，以確定最佳最佳反應條件為:枝桿菌最佳反應條件:in；94℃ 45 s，57.0℃ 45 s，72℃ 60 s，35cycle見圖 3.2。菌最佳反應條件:min；94℃ 30s，59.0℃ 30 s，72℃ 60 s，35cycl見圖 3.3。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳志艷;;奶牛結核病防控與凈化技術探討[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2019年08期

2 潘曉芳;李京芳;;奶牛結核病的檢測與防治[J];養(yǎng)殖與飼料;2019年05期

3 韓楠;;奶牛結核病的監(jiān)測及防治對策[J];中國畜禽種業(yè);2019年07期

4 李爽;肖開提·阿不都克力木;李威;阿曼古麗·加孜;范冰潔;;淺談新疆奶牛結核病的診斷與防治[J];新疆畜牧業(yè);2017年10期

5 劉志偉;楊永平;李東;談宇晴;方向東;阮征;;奶牛結核病的防控與凈化[J];中國奶牛;2017年11期

6 宮長富;;奶牛結核病的檢疫監(jiān)測方法[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2017年10期

7 周忠良;劉平;張軍;李穎;;奶牛結核病防控存在的問題及對策[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2018年01期

8 童奎;;奶牛結核病防控問題及策略探討[J];中國畜禽種業(yè);2018年02期

9 向玉玲;;奶牛結核病檢測及防控措施探討[J];中國畜禽種業(yè);2018年02期

10 曹忠良;時帥峰;;奶牛結核病的診斷與防治[J];中國動物保健;2018年04期

相關會議論文 前10條

1 李興榮;曾國熙;;奶牛結核病的防制策略和措施[A];中國畜牧獸醫(yī)學會——第三屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集[C];2012年

2 衛(wèi)龍興;顧炳龍;姚龍濤;;降低奶牛結核病誤檢率的研究和應用[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

3 何江;普菊惠;盧玉芬;凡選;普桂云;;開遠市奶牛結核病的調查與防控[A];第六屆云南省科協(xié)學術年會暨紅河流域發(fā)展論壇論文集——專題一：紅河流域特色產業(yè)轉型升級[C];2016年

4 李志源;梁明;;不同檢疫方法影響奶牛結核病陽性率的研究[A];首屆中國奶業(yè)大會論文集(上冊)[C];2010年

5 范鋒;毛愛民;李花;陸宇超;;地塞米松對2種奶牛結核病檢疫方法干擾作用的觀察[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2015年

6 徐鳳宇;高云航;何昭陽;;ELISA檢測乳中牛結核抗體的研究[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

7 劉琴;周亞平;謝麗韞;曾廣廳;李惠瓊;張任華;成玉梅;張利坤;施開平;李春;張泉鵬;;γ-干擾素釋放試驗和單純皮內變態(tài)反應診斷奶牛結核病對比試驗[A];第六屆中國奶業(yè)大會論文集[C];2015年

8 張桂榮;陳穎鈺;欽博;萬學濟;陳煥春;譚亞娣;;牛結核菌素酶聯(lián)免疫吸附反應方法用于診斷奶牛結核病的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學術研討會論文集[C];2005年

9 劉琴;謝麗韞;曾廣廳;張任華;周亞平;成玉梅;陳文忠;;奶牛結核病γ-IFN酶聯(lián)免疫法與皮內變態(tài)反應比較試驗[A];第五屆中國奶業(yè)大會論文集[C];2014年

10 金薇仙;;生產無公害牛奶結核病防治凈化是關鍵[A];第二屆全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2008年

相關重要報紙文章 前10條

1 承德縣農牧局 李秀芳;如何防控奶牛結核病[N];河北科技報;2016年

2 朱軒卿;奶牛結核病檢測難題破解[N];山東科技報;2013年

3 朱軒卿;揚大教授攻克我國奶牛結核病檢測難題[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2013年

4 薛勇;奶牛結核病的診斷與防治[N];中國畜牧報;2002年

5 嚴斯剛;奶牛結核病[N];中國畜牧報;2002年

6 本報記者 侯曜禹;奶牛結核病凈化計劃將在全國推廣[N];農民日報;2003年

7 汪學;奶牛結核病防治[N];云南科技報;2007年

8 中國奶業(yè)協(xié)會;奶牛結核病的防治[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2008年

9 張懷平;確保市民喝上“放心奶”[N];蚌埠日報;2008年

10 宋海峰 彭俊華;江西省重大動物疫情連續(xù)七年平穩(wěn)[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2013年

相關博士學位論文 前1條

1 王曲直;規(guī)模化奶牛場結核病的防控與凈化[D];揚州大學;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 葉麗;貴州省奶牛結核病、布魯氏菌病感染情況調查及牛奶安全性評價體系的建立[D];貴州大學;2019年

2 甘海霞;廣西奶牛結核病的監(jiān)測與防制[D];廣西大學;2008年

3 劉秀清;西寧市控制奶牛結核病調查及奶牛結核病病理學研究[D];甘肅農業(yè)大學;2004年

4 李志源;綜合防制技術在奶牛結核病中的應用[D];南京農業(yè)大學;2005年

5 田華;定西市安定區(qū)奶牛結核病流行病學與防制調查[D];甘肅農業(yè)大學;2004年

6 武燕;靖邊縣奶牛結核病和布魯氏菌病檢測與分析[D];西北農林科技大學;2015年

7 黃瑛;昌吉市奶牛結核病、布魯氏菌病普查與防治對策研究[D];西北農林科技大學;2005年

8 王曉玲;達州市奶牛結核桿菌病普查及防制技術措施[D];四川農業(yè)大學;2004年

9 王云霞;漢中地區(qū)奶牛結核病流行病學調查分析[D];西北農林科技大學;2007年

10 段旭基;陜西關中地區(qū)奶牛結核病調查與PCR檢測方法研究[D];西北農林科技大學;2009年

本文編號：2747628