【摘要】：硒是一種在人和動(dòng)物體內(nèi)維持機(jī)體生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要的微量元素,對(duì)機(jī)體內(nèi)分泌、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和生殖過(guò)程存在多重調(diào)控作用。硒缺乏可導(dǎo)致不同物種間的多種疾病,包括豬缺硒性桑葚心、雞的腦軟化、心肌損傷和人的克山病等等。此外,在禽類中,硒缺乏導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加和促進(jìn)炎癥發(fā)生,引起心肌細(xì)胞的凋亡、自噬和壞死發(fā)生,最終導(dǎo)致雞的心肌損傷。近年來(lái),miRNAs作為一種高度保守的小分子RNA,真核生物中廣泛存在,并在細(xì)胞死亡途徑和多種疾病發(fā)生過(guò)程中的重要調(diào)控作用,因此,逐漸成為研究的熱門話題,miRNA在心肌疾病中的調(diào)控仍有待研究。該試驗(yàn)基于肉雞的缺硒模型,對(duì)心肌組織的超微結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)結(jié)果進(jìn)行觀察,利用miRNA組學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)缺硒心肌組織中差異表達(dá)的miRNAs,通過(guò)生物信息學(xué)分析,選擇差異性最為顯著且與心肌疾病存在密切關(guān)系的miRNA-2954進(jìn)行后續(xù)研究,利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立體外miRNA-2954敲低/過(guò)表達(dá)模型,雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定用于確定靶向關(guān)系,并通過(guò)RT-PCR和Western印跡檢測(cè)體外和體內(nèi)的mRNA和蛋白質(zhì)水平。自噬染色和流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)心肌細(xì)胞中自噬和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。主要研究結(jié)果如下:1)在該試驗(yàn)中,將180只雛肉雞隨機(jī)分成兩組。向90只1日齡雛雞喂食低硒(硒含量為0.008 mg/kg)日糧,另外90只雛雞喂食正常日糧(硒含量0.2 mg/kg)30天。缺硒組肉雞出現(xiàn)典型的缺硒癥狀顯著的,剖檢心臟有出血點(diǎn),在超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果中可見(jiàn)心肌出現(xiàn)典型自噬和凋亡特征,證實(shí)成功復(fù)制缺硒性雞心肌損傷模型;病理組織學(xué)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,缺硒組心肌纖維明顯腫脹、斷裂以及明顯的單核細(xì)胞浸潤(rùn),證明缺硒可導(dǎo)致心肌組織的損傷。2)miRNA組學(xué)結(jié)果表明,雞心肌組織中共檢測(cè)出468個(gè)miRNA,其中缺硒組心肌組織與對(duì)照組相比,結(jié)果顯示,有11個(gè)miRNAs表達(dá)存在顯著差異,其中7個(gè)miRNAs上調(diào),4個(gè)miRNAs顯著減少,miRNA-2954的表達(dá)水平顯著增加(P0.05)。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證,與對(duì)照組相比,miRNA-2954的表達(dá)水平增加了3.5倍。上述結(jié)果證實(shí)miRNA組學(xué)的可靠性以及缺硒過(guò)程中,雞心肌組織中miRNA-2954表達(dá)顯著增加(P0.05)。3)基于組學(xué)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè),表明PI3K為miRNA-2954的靶基因之一,應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立miRNA-2954過(guò)表達(dá)和miRNA-2954敲低的肉雞原代心肌細(xì)胞,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞miRNA-2954的表達(dá)上升75倍,敲低組心肌細(xì)胞內(nèi)miRNA-2954降低了55%。表明原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞miRNA-2954的過(guò)表達(dá)/敲低模型建立成功;隨后結(jié)合雙熒光素酶基因報(bào)告檢測(cè),RTPCR及Western blot等試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PI3K為miRNA-2954的靶基因。4)缺硒肉雞心肌組織內(nèi)自噬相關(guān)基因IRS、RAS、MEK1、MEK2、ERK、TSC1、TSC2、ULK1、ATG13、LKB1、BECLIN1和LC3的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著上升,而抗自噬相關(guān)基因mTOR和AKT的表達(dá)水平顯著下降(P0.05);凋亡相關(guān)基因Caspase3、Caspase8、Caspase9、Cytc、BAX、BAK、P53、JNK和TNF的mRNA表達(dá)水平顯著升高,而B(niǎo)CL2的mRNA水平下降;自噬通路蛋白LC3和BECLIN1表達(dá)增加,mTOR表達(dá)顯著降低(P0.05);凋亡通路蛋白BAX,Caspase3,Caspase8表達(dá)增加,抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)下降。結(jié)果表明,缺硒可誘導(dǎo)心肌組織自噬和凋亡的發(fā)生。5)體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞,MDC染色顯示過(guò)表達(dá)miRNA-2954的心肌細(xì)胞自噬顯著增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組;miRNA-2954敲低組心肌細(xì)胞MDC染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示心肌細(xì)胞自噬和凋亡明顯低于對(duì)照組。綜上所述,miRNA-2954過(guò)表達(dá)可在雞心肌細(xì)胞內(nèi)通過(guò)抑制PI3K的表達(dá),導(dǎo)致PI3K/AKT通路下游促自噬和凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)上升,抗凋亡基因和蛋白的表達(dá)降低。機(jī)體缺硒過(guò)程中,肉雞心肌組織中miRNA-2954表達(dá)上調(diào),并通過(guò)靶向抑制PI3K通路表達(dá),導(dǎo)致心肌自噬和凋亡的發(fā)生,為缺硒引起的心肌疾病的診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ),為缺硒性心肌疾病的機(jī)制探究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31
【圖文】：

22圖 3-1 硒缺乏對(duì)肉雞心肌病理結(jié)構(gòu)的影響 The effects of selenium deficiency on histopathological structure of 雞心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果對(duì)照組心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整；硒缺乏組心肌組織發(fā)生明線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂（藍(lán)色箭頭）、染色質(zhì)邊集化及細(xì)亡的典型特性。此外，鏡下還可見(jiàn)包裹有細(xì)胞碎片和細(xì)胞器碎（紅色箭頭），這一現(xiàn)象是心肌細(xì)胞自噬的典型特征。證明硒損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和自噬。證實(shí)硒缺乏可誘導(dǎo)肉雞心肌建立了肉雞硒缺乏心肌組織損傷模型。

圖 3-2 硒缺乏對(duì)肉雞心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響Figure 3-2 The effects of selenium deficiency on ultrastructure of broiler cardiac3.3 硒缺乏肉雞心肌組織差異表達(dá) miRNA 分析結(jié)果圖 3-3 為缺硒組心肌組織內(nèi)與對(duì)照組相比差異表達(dá)的 miRNAs 分布情況。從差異倍數(shù)（Foldchange）和樣本校正后兩個(gè)水平的差異顯著性篩選分析結(jié)果，結(jié)果表明缺硒組心肌組織與對(duì)照組相比共有 11 個(gè) miRNA 在缺硒條件下出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，其中 4 個(gè) miRNAs 呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)（P<0.05），而 7 個(gè) miRNA 顯示出顯著的上升趨勢(shì)，其中 miRNA-2954 表達(dá)量顯著上升，miRNA-2954 的 log2（Fold change）值為 0.939（P<0.05）。

3-3 硒缺乏性肉雞心肌組織內(nèi)差異 miRNAs 篩選火volcano map for miRNAs in heart tissues for selenium心肌組織內(nèi) miRNA-2954 表達(dá)豐度肌組織中 miRNA-2954 的表達(dá)豐度。與對(duì)照組相比達(dá)水平存在顯著差異，增加至對(duì)照組的 3.2 倍（具體情況見(jiàn)圖 3-4。這表明 miRNA 組學(xué)結(jié)果的可54 的表達(dá)增加。

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