【摘要】：豬腹股溝/陰囊疝是一種常見的影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的發(fā)育異常疾病,主要發(fā)生在鞘狀突和腹股溝管的薄弱部位。該病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用產(chǎn)生的,但目前對影響豬腹股溝/陰囊疝的遺傳機(jī)制卻知之甚少。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期對120頭豬只個體(59頭患病個體和61頭健康個體)進(jìn)行特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing,SLAF-seq)的結(jié)果進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,并對豬腹股溝/陰囊疝的易感基因進(jìn)行篩選和功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1.將120個樣本分成三個群體(group 1:患病個體與健康個體;group 2:患病大約克豬,健康大約克豬,患病長白豬,健康長白豬患病雜交豬和健康雜交豬;group 3:患病法系豬,健康法系豬,患病美系豬與健康美系豬),利用FarmCPU(fixed and random model Circulating Probability Unification)模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,選擇兩種不同的閾值對關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行篩選。當(dāng)篩選閾值為系統(tǒng)默認(rèn)值p.threshold=0.01/標(biāo)記數(shù)時,共鑒定到21個與腹股溝/陰囊疝顯著關(guān)聯(lián)的SNPs(P0.01),定位了 9 個易感基因(AUH,TMPRSS3,UBASH3A,PTPN20B,VWA3B,NOL10,TENM3,PLCG2和NUAK)當(dāng)篩選閾值為推薦值 p.threshold=1E-05 時,共鑒定到6個新的與腹股溝/陰囊疝顯著關(guān)聯(lián)的SNPs(P0.01),定位了 3個新的易感基因(DEGS1,MEPE和PRKCE)。上述結(jié)果均經(jīng)過QQ圖檢驗(yàn)假陽性程度,發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與預(yù)測值擬合良好,關(guān)聯(lián)結(jié)果可靠。2.針對篩選出的5個與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(DEGS1,PLCG2,PRCE,NUAK1和TENM3)進(jìn)行擴(kuò)大群體驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在總?cè)后w和法系大約克豬中,PRKCE基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在患病、正常兩組中的分布差異顯著(P0.05);在所有群體中,DEGS1基因多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率以及基因型頻率的分布與陰囊疝的發(fā)生并沒有顯著的關(guān)聯(lián)(P0.05);在法系群體和法系長白群體中,NUAK1基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型的分布差異顯著(P0.05);在總?cè)后w中,PLCG2基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型的分布差異顯著(P0.05);在法系群體、法系長白群體和多元雜交群體中,TENM3基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布差異顯著(P0.05),而且在總?cè)后w和美系群體中,該基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布差異極顯著(P0.01)。3.根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果,選擇TENM3基因作為腹股溝/陰囊疝候選基因進(jìn)行初步功能研究。利用NNPP網(wǎng)站在線預(yù)測TENM3基因可能的核心啟動子區(qū)域,與pGL3-Basic構(gòu)建重組載體,通過雙熒光活性檢測發(fā)現(xiàn)TENM3-2片段的熒光活性最高(P0.01),將其定義為TENM3基因的核心啟動子區(qū)域。構(gòu)建包含核心啟動子TENM3-2和不同基因型(G/T)內(nèi)含子片段的重組pGL3-Basic載體,雙熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)pGL3-P2-G的熒光活性顯著高于pGL3-P2-T(P0.05)。干擾預(yù)測的可能與目標(biāo)SNP位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子RUNX2后,細(xì)胞晚期凋亡數(shù)量未發(fā)生顯著變化(P0.05),但TENM3的蛋白和mRNA水平均顯著降低(p0.05)。結(jié)果說明TENM3基因該SNP位點(diǎn)可以影響轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的結(jié)合,且該轉(zhuǎn)錄因子可能具有抑制TENM3基因轉(zhuǎn)錄激活的作用。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28
【圖文】：

果與預(yù)測值擬合良好，關(guān)聯(lián)結(jié)果可靠。逡逑在ｇｒｏｕｐ邋１中，檢測出兩個顯著ＳＮＰ位點(diǎn)（ｒｓ３１９７６７７５７，ｐ＝１．２４Ｅ－０６和逡逑＾３２０４９７３１１，口＝２．１９￡－０６）與己知基因４＾／／／重疊（圖３－１八，８）；在奸0叩２中逡逑共檢測出９個顯著ＳＮＰ位點(diǎn)與己知兄Ｓ幻（ｒｓ３４５５４４９７８，ｐ＝６．９０Ｅ－０６；逡逑ｒｓ３４０９５９２５０，邋ｐ＝５．６０Ｅ－０６）邋，邋ＵＢＡＳＨ３Ａ邋（ｒｓ７０３８４９３３９，邋ｐ＝６．９０Ｅ－０６；邋ｒｓ３２７３８３８０２，逡逑ｐ＝６．９０Ｅ－０６；邋ｒｓ３４０５３２６５７，邋ｐ＝２．３３Ｅ－０６；邋ｒｓ３２９１９２９０９，邋ｐ＝８．９１Ｅ－０７）邋，邋ＰＴＰＮ２０Ｂ逡逑（ｒｓ６９１３４１３６５，邋ｐ＝７．７６Ｅ－０６）邋＞邋ＶＷＡ３Ｂ邋（ｒｓ３３１９３２５１８，邋ｐ＝２．５５Ｅ－０６）邋，邋ＮＵＡＫ１逡逑（ｒｓ３４４３１５０７８，邋ｐ＝１．３５Ｅ－０６）基因重疊，其中有６個ＳＮＰ位于１３號染色體上（圖逡逑３－１（：，０）；在８１＇0叩３中檢測到４個與已知基因７＾’添心（＾６９３３１２0５２，？＝２．２６￡－１１）、逡逑ＮＯＬ１０邋（邋ｒｓ３４３６９５９５２邋，邋ｐ＝４．６０Ｅ－０６；邋ｒｓ３３７９８８４５０邋，邋ｐ＝４．６０Ｅ－０６邋）邋，邋ＰＬＣＧ２逡逑（ｒｓ３３６８３９４５５

共檢測到１６個在基因組水平上與豬腹股溝／陰囊疝顯著相關(guān)的目標(biāo)基因（表３－２）。逡逑在ｇｒｏｕｐ邋１中，共篩選到９個與腹股溝／陰囊疝顯著關(guān)聯(lián)的ＳＮＰ，但是并未定逡逑位到已知基因上（圖３－２Ａ，Ｂ）；在ｇｒ0ｕｐ２中，檢測到６個與陰囊疝顯著關(guān)聯(lián)的逡逑標(biāo)記，并定位到邐（ｒｓ３４２３７０９３０，ｐ＝１．７１Ｅ－０７）、（ｒｓ３３１９３２５１８，逡逑ｐ＝５．６９Ｅ－０８）、／＾／ＣＣ￡（ｒｓ３２８６８１９４２，邋ｐ＝１．５３Ｅ－０９；邋ｒｓ３２９０７６４８１，ｐ＝ｌ．ｌｌＥ－０６）、．逡逑Ｍ７NBＯ邋（ｒｓ３４４３１５０７８，邋ｐ＝８＿ｌｌＥ－１０）和邐（ｒｓ３４０２３２８５７，ｐ＝３．５６Ｅ－０６）基因逡逑上。其中兩個位點(diǎn)ｒｓ３２８６８１９４２邋（尸／？}：￡）和ｒｓ３４４３１５０７８邐與腹股溝／逡逑陰囊疝的關(guān)聯(lián)達(dá)到極顯著水平，同時兩個ＳＮＰ位點(diǎn)ｒｓ３３１９３２５１８邋（ＷＨ３５）和逡逑ｒｓ３４４３１５０７８邋（）在閾值邋ｐ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０１／Ｎ邋時同樣關(guān)聯(lián)顯著（圖邋３－２邋Ｃ，邋Ｄ）；逡逑在ｇｒｏｕｐ３中閾值為１Ｅ－０５和０．０１／Ｎ時篩選到的結(jié)果一致（圖３－２邋Ｅ，Ｆ）。逡逑３４逡逑

對ＰＭＣ五基因包含該ＳＮＰ邋（ｒｓ３２８６８１９４２）的部分序列進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，大逡逑小為４４１ｂｐ。并挑選出１０個不同樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物混合測序，發(fā)現(xiàn)在ｒｓ３２８６８１９４２逡逑上存在一個Ｃ／Ｔ突變（圖３－３邋Ａ）。并且這一突變可被限制性內(nèi)切酶ｒ叫Ｉ識別，逡逑采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技術(shù)，酶切后可產(chǎn)生三種基因型：ＴＴ基因型（４４１ｂｐ）、ＣＣ基逡逑因型（２２９ｂｐ／２１２ｂｐ）、Ｃ／Ｔ基因型（４４１ｂｐ／２２９ｂｐ／２１２ｂｐ），酶切瓊脂糖電泳結(jié)果逡逑（圖３－３邋Ｂ）所示。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｍ２°°ｍ邐．邋＿２ｉ０＿邋■邐Ｍ邋１邐２邐３邐４逡逑ＧＧＧ邋ＡＣＣ邋Ｔ邋ｆ邋Ｇ邋ＡＴＣＴＴ逡逑邐Ｉ逡逑圖３－３Ｐ／＾Ｃ￡基因ｒｓ３２８６８１９４２位點(diǎn)多態(tài)產(chǎn)物。Ａ：測序結(jié)果；Ｂ：瓊脂糖凝膠電泳圖逡逑Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ２０００；邋Ｃ／Ｔ：邋１；邋ＣＣ：邋２；邋ＴＴ：邋３，４逡逑Ｆｉｇ．邋３－３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｒｓ３２８６８１９４２邋ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．邋Ａ：邋ｔｈｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ；邋Ｂ：邋ｔｈｅ逡逑ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｄａｔａ邋Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ邋２０００；邋Ｃ／Ｔ：邋１；邋ＣＣ：邋２；邋ＴＴ：邋３，４逡逑對基因的７＾１－ＲＦＬＰ位點(diǎn)，在１０９頭法系大約克豬、５３頭法系長白逡逑豬和３９頭美系豬中進(jìn)行基因型和基因頻率分布的獨(dú)立性檢驗(yàn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2746661