【摘要】：RNAscope原位雜交(RNAscope in situ hybridization,簡稱RNAscope~?)是一種新型原位雜交技術(shù),其原理為堿基互補配對原則,結(jié)合信號級聯(lián)放大技術(shù)和背景抑制策略使得該技術(shù)在實驗室檢測中具有一定優(yōu)勢。本實驗利用RNAscope~?成功檢測到感染動物組織切片中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),并對其特異性進行檢測,結(jié)果顯示,該技術(shù)在PRRSV檢測中具有較高特異性。將RNAscope~?、原位雜交技術(shù)(In situ hybridization,ISH)和免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)進行比較時,在連續(xù)切片上分別使用三種技術(shù)檢測PRRSV,定量分析陽性結(jié)果表明,RNAscope~?具有更高的敏感性。圖像分析結(jié)果顯示,在肺臟中,RNAscope~?與ISH陽性信號的位置與數(shù)量基本一致,然而IHC結(jié)果顯示PRRSV陽性信號明顯少于前兩者。在胸腺組織中,RNAscope~?陽性信號在皮質(zhì)區(qū)大量出現(xiàn);ISH檢測中,陽性信號在皮質(zhì)區(qū)局部出現(xiàn);而IHC結(jié)果中,胸腺皮質(zhì)區(qū)PRRSV陽性信號較少。在淋巴結(jié)組織中,三種技術(shù)檢測PRRSV呈現(xiàn)的陽性信號出現(xiàn)的位置一致,但是RNAscope~?信號數(shù)量最多,IHC檢測結(jié)果次之,ISH陽性信號少于前兩者。初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,RNAscope~?的敏感性顯著高于ISH和IHC。為擴展RNAscope~?和IHC技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,本研究以PRRSV感染的組織石蠟切片為樣本,建立了RNAscope~?與IHC雙重染色技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合RNAscope~?獨特探針與IHC特異性抗原兩大優(yōu)勢,實現(xiàn)了在同一切片上核酸與蛋白的雙重檢測。在肺臟及淋巴結(jié)中,利用RNAscope~?檢測PRRSV結(jié)合IHC檢測巨噬細胞,結(jié)果顯示RNAscope~?與IHC均呈現(xiàn)出較好的特異性和敏感性。PRRSV感染宿主后,會引起細胞凋亡,基于此在組織切片上應(yīng)用RNAscope~?檢測宿主凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因Bid和Bcl-xl結(jié)合IHC檢測PRRSV雙重染色,結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PRRSV感染組織中的Bid基因表達水平有上調(diào)趨勢,Bcl-xl基因表達水平有下調(diào)趨勢,表明該技術(shù)在檢測內(nèi)源性基因過程中也有良好表現(xiàn)。綜上,本研究成功建立了RNAscope~?與IHC雙重染色技術(shù)。本研究應(yīng)用RNAscope~?技術(shù)成功檢測到組織切片中的PRRSV核酸,同時證明該技術(shù)操作簡便,并具有高度的特異性、敏感性和重復(fù)性。RNAscope~?與IHC雙重染色結(jié)果證實該技術(shù)不僅在病毒檢測中具有高敏感性,在內(nèi)源基因表達及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基礎(chǔ)研究中也有廣泛的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651
【圖文】：

與呼吸綜合征是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive anvirus，PRRSV）引起的重要的豬傳染性疾病，世界動物衛(wèi)生組織（Office inte，OIE）將其列為 B 類傳染病。近三十年來給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重家推算，每頭十八周齡發(fā)病豬將造成接近 121.5 美元的經(jīng)濟損失(Nieuw重的經(jīng)濟學(xué)和生態(tài)學(xué)影響促使該病成為目前豬病領(lǐng)域中的研究熱點和重點，驗室正在對該病的致病機理進行深入研究。原學(xué)特點 病毒粒子呈球形, 為直徑 60~65 nm 的有囊膜的 RNA 病毒(Wensvoort, 1991性，僅感染豬。目前該病毒有兩個基因型分別為歐洲型（1 型）和美洲型999)。在病毒分類學(xué)中，PRRSV 與馬動脈炎病毒（Equine arteritis virus，EA增高癥病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV）和猴出血熱病ic fever virus，SHFV）等同為尼多病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒rg et al., 1993)。妊娠母豬感染 PRRSV 會發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)出死胎或木乃伊豬會出現(xiàn)嚴重的呼吸道癥狀，造成缺氧，從而出現(xiàn)機體末端例如耳朵發(fā)紫被稱為藍耳病(Rahe et al., 2017)或神秘豬病。

碩士學(xué)位論文 原位雜交技術(shù)。該技術(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)微拷貝技術(shù)增強對于 mRNA 的檢scope 技術(shù)的原理是基于堿基互補配對原則，結(jié)構(gòu)獨特的雙 Z 形探合，再通過信號放大系統(tǒng)標(biāo)記目的序列作為陽性信號呈現(xiàn)在鏡下（點在于雙 Z 探針的設(shè)計，該探針的結(jié)構(gòu)為三段式 Z 型，下端為靶標(biāo)中核酸結(jié)合的核心區(qū)域，長度約為 25 bp；上端為信號放大結(jié)合區(qū)統(tǒng)的骨架根據(jù)堿基互補配對原則結(jié)合，為信號結(jié)合提供支架，長度上端和下端的作用。探針的成對設(shè)計使得非目的序列上的單個 Z 探，大大降低了背景和噪點。該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)短序列 mRNA 甚至單個益于這一點，進而可以擴展到 RNAscope 的一個特殊的功能，就是降存時間較長的樣本中，RNA 存在降解，但只要片段長度不小于 50 b技術(shù)的敏感性，克服了 RNA 容易降解的問題。

引入到這一診斷領(lǐng)域中能夠互補目前的主流檢測手段(Yu et al.)。Talita 等在豬各組織器官中檢測豬塞內(nèi)加谷病毒(Seneca valley virus，SVV)時發(fā)現(xiàn)，在臨床中認為是機械損傷的舌面潰爛處RNAscope 檢測發(fā)現(xiàn)了 SVV 的存在，同時也通過 PCR 的技術(shù)確定了這一診斷的正確性，因此懷疑該病毒在損傷組織中易感(Resende et al., 2017)。同時 RNAscope 的技術(shù)優(yōu)勢為其在基礎(chǔ)研究中的推廣與接受奠定了基礎(chǔ)。Kim 等在對乳腺分葉狀腫瘤的惡化程度分級中，發(fā)現(xiàn)在 RNAscope 診斷結(jié)果中，隨著腫瘤惡性程度的加重，富含半胱氨酸的酸性基質(zhì)蛋白的 RNA 水平和蛋白水平均顯著上調(diào)，一定程度上證明了該類型蛋白與腫瘤惡化相關(guān)(Kim et al., 2017)。在研究炎癥的相關(guān)機理時，應(yīng)用 RNAscope 確定關(guān)鍵因子 ACN9不僅在肺臟上皮組織中存在，也是肺臟淋巴組織中的重要表達因子，深入研究發(fā)現(xiàn)將該因子沉默會促進炎性因子的表達(Jeong et al., 2017)。通過對相關(guān)基因在神經(jīng)細胞病變區(qū)的分布和表達量改變的檢測，發(fā)現(xiàn)基因表達的不同調(diào)節(jié)機制(Kanaan et al., 2015)。利用不同的關(guān)鍵標(biāo)志物來區(qū)分不同極化狀態(tài)的巨噬細胞來研究病原或腫瘤發(fā)生時，巨噬細胞的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的改變，同時針對重要細胞因子的檢測，也對胰腺癌的相關(guān)臨床癥狀進行了簡單的解釋(Liou et al., 2017)。RNAscope 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和生物研究中得到高度的認可，不僅能夠利用腫瘤標(biāo)記物來快速診斷癌癥的發(fā)生與發(fā)展，同時也為基礎(chǔ)研究提供了一個新的平臺和方向。目前，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各方面都應(yīng)用較少，但是 RNAscope 技在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的成功推廣提示著該技術(shù)也將為獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來一場技術(shù)的革命。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 周磊;楊漢春;姜平;童光志;閆恒普;;豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控技術(shù)與應(yīng)用[J];中國畜牧雜志;2015年06期

2 楊漢春;;主要豬病流行現(xiàn)狀、防控面臨的問題與對策[J];獸醫(yī)導(dǎo)刊;2014年11期

3 孫廣力;蔡雪輝;鄭世民;孫剛;榮福龍;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬動脈血管內(nèi)皮細胞上的培養(yǎng)特性[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2010年10期

本文編號：2746285