【摘要】：長鏈脂酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase,ACSLs)是生物合成途徑中必需的酶,有助于活化脂肪酸,主要催化其鏈長度為12-20個碳的脂肪酸。ACSLs是哺乳動物中幾乎所有代謝途徑的一個完整的初始步驟,如復雜的脂質合成、蛋白質修飾和脂肪酸β-氧化。ACSL3是ACSLs家族的成員,含有高水平的多不飽和脂肪酸磷脂,在內質網(ER)和大多數組織的脂滴中廣泛表達。ACSL3能夠調節(jié)脂肪細胞分化關鍵轉錄因子的活性,有助于維持脂質平衡,參與脂肪酸的吸收。目前,關于ACSL3基因在肉牛前體脂肪細胞向脂肪細胞分化過程中的機制及遺傳多態(tài)性的研究還不清楚。為探究ACSL3基因對牛脂代謝調控作用及遺傳多態(tài)性功能,試驗以ACSL3基因為研究對象,通過構建過表達載體及siRNA方法,解析ACSL3基因在前體脂肪細胞向脂肪細胞分化過程中的作用。同時,在中國草原紅牛群體水平中,通過Sanger直接測序技術對ACSL3基因進行多態(tài)性檢測,分析其SNPs與肉牛肉質性狀的相關性。主要研究結果如下:(1)成功克隆中國草原紅牛ACSL3基因,同時進行了相關生物信息學分析,并分析了ACSL3基因在各組織間的mRNA及蛋白表達差異。(2)成功分離中國草原紅牛前體脂肪細胞,確定ACSL3基因在牛前體脂肪細胞誘導分化過程中mRNA及蛋白的表達規(guī)律。(3)構建過表達載體與siRNA,分別轉染于牛前體脂肪細胞中。在成脂分化過程中,過表達ACSL3基因能夠顯著提高PPARγ和C/EBPα的mRNA及蛋白含量(P0.05),而干擾ACSL3基因則顯著降低PPARγ和C/EBPα的mRNA及蛋白含量(P0.05);ACSL3基因過表達能夠顯著提高中國草原紅牛脂肪細胞中脂滴和甘油三酯含量(P0.05),而干擾ACSL3基因能顯著降低細胞中脂滴和甘油三酯含量(P0.05)。(4)以中國草原紅牛為研究對象,對ACSL3基因15個外顯子進行SNP位點檢測,發(fā)現僅第6外顯子在g.111870595位置存在一個G-A突變(E6-GA)。結合肉質性狀進行了相關分析,發(fā)現該突變在中國草原紅牛的花生酸、亞油酸、剪切力、脂肪含量和水分含量中存在顯著差異。綜上所述,在中國草原紅牛成脂分化過程中,ACSL3基因能夠促進細胞中甘油三酯和脂滴合成,促進成脂分化標志基因的表達,對脂肪細胞分化具有正向調節(jié)作用;同時,ACSL3基因在編碼區(qū)發(fā)生g.111870595 GA(E6-GA)突變,與脂肪酸含量、部分肉質性狀存在相關性。研究結果可以為進一步探究ACSL3基因的功能及應用提供基礎材料,為牛脂代謝及脂肪沉積的相關研究提供理論依據。
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

1.2 RT-PCR 產物；M，DL2000 DNA Mar1.2RT-PCRproduct;M,DL2000DNAMarke 1. 1 中國草原紅牛 ACSL3 基因編碼區(qū) PCRtrophoregram of ACSL3 coding region in因序列的生物信息學分析比對及系統(tǒng)進化樹構建 BLAST 對中國草原紅牛 ACSL3 基因 C68.2）、綿羊（登錄號：XM_00400496）、人（登錄號：NM_001354158）、大鼠（登NM_057107.1）、雞（登錄號：XM_015源性比對發(fā)現，中國草原紅牛 ACSL3 基的同源性分別為：99%、97%、93%、91苷酸系統(tǒng)進化樹，結果發(fā)現，中國草原親緣關系最遠（圖 1.2），所構建的系分子水平差異。

1.2 RT-PCR 產物；M，DL2000 DNA Marker1.2RT-PCRproduct;M,DL2000DNAMarker圖 1. 1 中國草原紅牛 ACSL3 基因編碼區(qū) PCR 擴增電泳圖Fig 1.1 PCR electrophoregram of ACSL3 coding region in Chinese Red Steppe Ca1.2.2 ACSL3 基因序列的生物信息學分析1.2.2.1 同源性比對及系統(tǒng)進化樹構建通過 NCBI 中 BLAST 對中國草原紅牛 ACSL3 基因 CDS 核苷酸序列與牛（登號：NM_001205468.2）、綿羊（登錄號：XM_004004964.3）、豬（登錄號：NM_001143698.1）、人（登錄號：NM_001354158）、大鼠（登錄號：NM_001136222.小鼠（登錄號：NM_057107.1）、雞（登錄號：XM_015277033.2）ACSL3 基因苷酸序列進行同源性比對發(fā)現，中國草原紅牛 ACSL3 基因與牛、綿羊、豬、大鼠、小鼠、雞的同源性分別為：99%、97%、93%、91%、88%、88%、78%；并Mega6.0 構建核苷酸系統(tǒng)進化樹，結果發(fā)現，中國草原紅牛與牛、綿羊的親緣系最近，與雞的親緣關系最遠（圖 1.2），所構建的系統(tǒng)進化樹可以直觀的表不同物種之間的分子水平差異。

ACSL3 基因共編碼 720 個氨基酸，ACSL3 蛋白分子式 C3597H5703N955O1044S39，總原子數 11338，分子量為 80.28 kDa，理論等電點為 8.74，氨基酸組成結果顯示，共包含 18 種氨基酸，其中亮氨酸（L）所占的比例最高 9.7%（70 個氨基酸），色氨酸（W）所占的比例最低 1.1%（8 個氨基酸），同時包含 75 個負電荷氨基酸堿基（天冬氨酸 D+谷氨酸 E），包含 87 個正電荷氨基酸（精氨酸 R+賴氨酸 K），消光系數 88335，不穩(wěn)定系數為 32.68，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白，預計的半衰期為 30h，脂肪系數為 88.43，總平均親水性為-0.195，蛋白表現出親水性，進一步使用 Protscale 軟件分析其蛋白親疏水性發(fā)現，該蛋白為親水性蛋白（圖 1.3）。

【參考文獻】

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本文編號：2745948