【摘要】：長鏈脂酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase,ACSLs)是生物合成途徑中必需的酶,有助于活化脂肪酸,主要催化其鏈長度為12-20個碳的脂肪酸。ACSLs是哺乳動物中幾乎所有代謝途徑的一個完整的初始步驟,如復(fù)雜的脂質(zhì)合成、蛋白質(zhì)修飾和脂肪酸β-氧化。ACSL3是ACSLs家族的成員,含有高水平的多不飽和脂肪酸磷脂,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和大多數(shù)組織的脂滴中廣泛表達(dá)。ACSL3能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活性,有助于維持脂質(zhì)平衡,參與脂肪酸的吸收。目前,關(guān)于ACSL3基因在肉牛前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中的機制及遺傳多態(tài)性的研究還不清楚。為探究ACSL3基因?qū)εＶx調(diào)控作用及遺傳多態(tài)性功能,試驗以ACSL3基因為研究對象,通過構(gòu)建過表達(dá)載體及siRNA方法,解析ACSL3基因在前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中的作用。同時,在中國草原紅牛群體水平中,通過Sanger直接測序技術(shù)對ACSL3基因進(jìn)行多態(tài)性檢測,分析其SNPs與肉牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下:(1)成功克隆中國草原紅牛ACSL3基因,同時進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析,并分析了ACSL3基因在各組織間的mRNA及蛋白表達(dá)差異。(2)成功分離中國草原紅牛前體脂肪細(xì)胞,確定ACSL3基因在牛前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中mRNA及蛋白的表達(dá)規(guī)律。(3)構(gòu)建過表達(dá)載體與siRNA,分別轉(zhuǎn)染于牛前體脂肪細(xì)胞中。在成脂分化過程中,過表達(dá)ACSL3基因能夠顯著提高PPARγ和C/EBPα的mRNA及蛋白含量(P0.05),而干擾ACSL3基因則顯著降低PPARγ和C/EBPα的mRNA及蛋白含量(P0.05);ACSL3基因過表達(dá)能夠顯著提高中國草原紅牛脂肪細(xì)胞中脂滴和甘油三酯含量(P0.05),而干擾ACSL3基因能顯著降低細(xì)胞中脂滴和甘油三酯含量(P0.05)。(4)以中國草原紅牛為研究對象,對ACSL3基因15個外顯子進(jìn)行SNP位點檢測,發(fā)現(xiàn)僅第6外顯子在g.111870595位置存在一個G-A突變(E6-GA)。結(jié)合肉質(zhì)性狀進(jìn)行了相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)該突變在中國草原紅牛的花生酸、亞油酸、剪切力、脂肪含量和水分含量中存在顯著差異。綜上所述,在中國草原紅牛成脂分化過程中,ACSL3基因能夠促進(jìn)細(xì)胞中甘油三酯和脂滴合成,促進(jìn)成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá),對脂肪細(xì)胞分化具有正向調(diào)節(jié)作用;同時,ACSL3基因在編碼區(qū)發(fā)生g.111870595 GA(E6-GA)突變,與脂肪酸含量、部分肉質(zhì)性狀存在相關(guān)性。研究結(jié)果可以為進(jìn)一步探究ACSL3基因的功能及應(yīng)用提供基礎(chǔ)材料,為牛脂代謝及脂肪沉積的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

1.2 RT-PCR 產(chǎn)物；M，DL2000 DNA Mar1.2RT-PCRproduct;M,DL2000DNAMarke 1. 1 中國草原紅牛 ACSL3 基因編碼區(qū) PCRtrophoregram of ACSL3 coding region in因序列的生物信息學(xué)分析比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 BLAST 對中國草原紅牛 ACSL3 基因 C68.2）、綿羊（登錄號：XM_00400496）、人（登錄號：NM_001354158）、大鼠（登NM_057107.1）、雞（登錄號：XM_015源性比對發(fā)現(xiàn)，中國草原紅牛 ACSL3 基的同源性分別為：99%、97%、93%、91苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國草原親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖 1.2），所構(gòu)建的系分子水平差異。

1.2 RT-PCR 產(chǎn)物；M，DL2000 DNA Marker1.2RT-PCRproduct;M,DL2000DNAMarker圖 1. 1 中國草原紅牛 ACSL3 基因編碼區(qū) PCR 擴增電泳圖Fig 1.1 PCR electrophoregram of ACSL3 coding region in Chinese Red Steppe Ca1.2.2 ACSL3 基因序列的生物信息學(xué)分析1.2.2.1 同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建通過 NCBI 中 BLAST 對中國草原紅牛 ACSL3 基因 CDS 核苷酸序列與牛（登號：NM_001205468.2）、綿羊（登錄號：XM_004004964.3）、豬（登錄號：NM_001143698.1）、人（登錄號：NM_001354158）、大鼠（登錄號：NM_001136222.小鼠（登錄號：NM_057107.1）、雞（登錄號：XM_015277033.2）ACSL3 基因苷酸序列進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，中國草原紅牛 ACSL3 基因與牛、綿羊、豬、大鼠、小鼠、雞的同源性分別為：99%、97%、93%、91%、88%、88%、78%；并Mega6.0 構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國草原紅牛與牛、綿羊的親緣系最近，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖 1.2），所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以直觀的表不同物種之間的分子水平差異。

ACSL3 基因共編碼 720 個氨基酸，ACSL3 蛋白分子式 C3597H5703N955O1044S39，總原子數(shù) 11338，分子量為 80.28 kDa，理論等電點為 8.74，氨基酸組成結(jié)果顯示，共包含 18 種氨基酸，其中亮氨酸（L）所占的比例最高 9.7%（70 個氨基酸），色氨酸（W）所占的比例最低 1.1%（8 個氨基酸），同時包含 75 個負(fù)電荷氨基酸堿基（天冬氨酸 D+谷氨酸 E），包含 87 個正電荷氨基酸（精氨酸 R+賴氨酸 K），消光系數(shù) 88335，不穩(wěn)定系數(shù)為 32.68，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白，預(yù)計的半衰期為 30h，脂肪系數(shù)為 88.43，總平均親水性為-0.195，蛋白表現(xiàn)出親水性，進(jìn)一步使用 Protscale 軟件分析其蛋白親疏水性發(fā)現(xiàn)，該蛋白為親水性蛋白（圖 1.3）。

【參考文獻(xiàn)】

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1 葉婷婷;黃艷紅;方芳;劉沖霄;陳源文;董艷;;母代大鼠高脂飲食對子代早期肝內(nèi)脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響[J];臨床兒科雜志;2015年02期

2 李科;陳怡;董艷;葉志強;;ACSL3在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對前列腺癌轉(zhuǎn)移的影響[J];中國病理生理雜志;2014年02期

3 董炳梅;王金良;張春玲;魏鳳;呂素芳;祖立闖;汪洋;沈志強;;蛋白質(zhì)的糖基化作用及其在生物制藥中的應(yīng)用[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年11期

4 唐立群;肖層林;王偉平;;SNP分子標(biāo)記的研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2012年12期

5 趙鵬;徐霞紅;周立分;劉欣;聶舟;姚守拙;;磷酸化蛋白質(zhì)分析[J];化學(xué)傳感器;2011年01期

6 潘英樹;張永宏;高妍;秦瑩;馬倩;劉同欣;陳承禎;劉國文;王哲;趙志輝;張嘉保;;草原紅牛血液蛋白多態(tài)性及與生產(chǎn)性能相關(guān)性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2009年12期

7 姜錚;王芳;何湘;劉大偉;陳宣男;趙紅慶;黃留玉;袁靜;;蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2009年02期

8 屈長青,張國華,陳粉粉,趙麗麗,楊公社;豬前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2005年05期

9 劉正遠(yuǎn),袁纓;影響肉質(zhì)的生物化學(xué)和組織學(xué)因素[J];飼料工業(yè);2005年11期

10 王竹晨,劉建中,李燕,楊冬梓,鄺健全;人前脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J];中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年06期

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1 呂艷濤;母豬乳脂合成關(guān)鍵基因篩選及長鏈脂肪酸對乳脂合成的調(diào)控研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 詹小立;牛ATGL基因?qū)εＶ炯?xì)胞中甘油三酯積累的調(diào)控作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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1 王歡;PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 原利榮;內(nèi)毒素對奶牛乳腺組織免疫活化狀態(tài)及乳脂肪和乳蛋白合成的影響及其控制[D];西南大學(xué);2015年

本文編號：2745948