【摘要】：卵母細(xì)胞成熟是影響雌性動物繁殖能力的重要因素之一,卵母細(xì)胞成熟過程需要消耗大量的能量,脂肪酸的β-氧化是卵母細(xì)胞成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的重要能量來源之一,在卵母細(xì)胞成熟及胚胎附植過程中發(fā)揮重要作用。乙酰基-L-肉堿(Acety-L-carnitine,ALC)能促進(jìn)脂肪酸的β-氧化,目前探討ALC與哺乳動物繁殖性能相關(guān)研究尚少,已有的數(shù)據(jù)證實ALC具有緩解小鼠早期胚胎氧化應(yīng)激及促進(jìn)羔羊卵母細(xì)胞脂類代謝等功能,但ALC影響水牛卵母細(xì)胞體外成熟及相關(guān)研究缺乏且機(jī)制不清楚。本研究探討了 ALC對水牛卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的影響,并利用質(zhì)譜技術(shù)初步解析了 ALC影響卵母細(xì)胞脂類指紋圖譜及代謝液代謝指紋圖譜的變化,本文的主要研究結(jié)果如下:1.探討了體外成熟液添加ALC對水牛卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的影響。首先為了確定ALC添加的較佳濃度,試驗設(shè)計了 0 mM,1.25 mM,2.5 mM和5 mM的不同添加濃度組,結(jié)果表明,2.5 mM組所得的囊胚率顯著高于其它各組(P0.05)。后續(xù)研究以2.5 mM為較佳添加濃度檢測ALC影響卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的各評定指標(biāo),結(jié)果顯示,相比不添加組,ALC添加組卵丘細(xì)胞具有顯著性的增殖能力(P0.05);卵母細(xì)胞中ROS含量顯著下降(P0.05)及呈均勻線粒體分布的卵母細(xì)胞比例顯著上升(P0.05);卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中mtDNA含量顯著升高(P0.05);E2分泌顯著增加(P0.05);ALC組卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中P450scc和GDF9兩個基因相對表達(dá)量顯著高于不添加組(P0.05)。因此,ALC通過降低ROS含量和調(diào)節(jié)線粒體功能、提高旁分泌因子的表達(dá)及增加類固醇分泌,促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育。2.通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Ultra Performance Liquid Chromatography mass spectrometry,UPLC-MS),探討了 ALC 對水牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的代謝液代謝指紋圖譜影響。利用OPLS-DA多元分析方法分析質(zhì)譜數(shù)據(jù),篩選出7種顯著性差異代謝物,其中Dopaxanthin(與抗氧化性相關(guān)),O-acetyl-ADP-ribose(Sirtuins基因的中間代謝產(chǎn)物,與抗氧化和抗衰老相關(guān))和Aldosterone 18-glucuronide(類固醇及類固醇衍生物)在ALC添加組的含量顯著高于不添加組(P0.05)。而(S)-a-Amino-2,5-dihydro-5-oxo-4-isoxazolepropanoic acid N2-glucoside(葡萄糖苷),Lactose 6-phosphate(乳酸磷酸鹽,與葡萄糖代謝相關(guān),參與半乳糖代謝及能量代謝信號通路),Fumaric acid(三羧酸中間物質(zhì),參與三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化信號通路)和D-Glucurono-6,3-lactone(葡萄糖醛酸內(nèi)酯,葡萄糖代謝產(chǎn)物)在ALC添加組的含量顯著低于不添加組(P0.05)。因此,在水牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體體外成熟過程中,添加ALC下調(diào)了卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體糖代謝相關(guān)代謝產(chǎn)物,上調(diào)了抗氧化代謝及類固醇生成相關(guān)代謝產(chǎn)物。3.通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù),探討了 ALC對成熟卵母細(xì)胞脂類指紋圖譜的影響。利用OPLS-DA多元分析方法分析質(zhì)譜數(shù)據(jù),篩選出3個脂類離子(m/z 728.7[PC(32:3)],768.8[PC(P-36:3)]和894.9[TAG(58:8)])在ALC添加組卵母細(xì)胞中含量顯著低于未添加組(P0.05)。經(jīng)Nile Red染色對各組卵母細(xì)胞總脂含量進(jìn)行測定,結(jié)果顯示ALC添加組總脂含量顯著低于未添加組(P0.05)。因此,在水牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中,添加ALC可顯著降低成熟卵母細(xì)胞總脂含量,并降低了磷脂離子和甘油三酯離子的含量。4.利用分子生物學(xué)和MALDI-TOFMS技術(shù)探討了 ALC對成熟卵母細(xì)胞冷凍效果的影響。利用O2PLS-DA多元分析方法分析質(zhì)譜數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,與未添加冷凍組相比,ALC組可顯著提高冷凍解凍后孤雌激活胚胎的分裂率、桑椹胚率、囊胚率及解凍后卵母細(xì)胞的線粒體膜電位(P0.05),并得到了 5種顯著變化的磷脂離子(m/z 728.7[PC(32:3)],746.9[PC(32:5)],760.6[PC(34:1)],768.8[PC(P-36:3)]和 782.6[PC(36:4)];P0.05)在新鮮未添加組含量顯著高于未添加冷凍組;3種磷脂離子(m/z 734.6[PC(32:0)],760.6[PC(34:1)]和 782.6[PC(36:4)];P0.05)在 ALC 添加冷凍組含量顯著高于未添加冷凍組。因此,在水牛卵母細(xì)胞成熟過程中,添加ALC可通過維持線粒體膜電位和磷脂含量促進(jìn)解凍后體外成熟卵母細(xì)胞后續(xù)胚胎發(fā)育效果。總之,本研究結(jié)果說明ALC通過調(diào)節(jié)線粒體功能、旁分泌因子及類固醇激素表達(dá)和脂類代謝,促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育。本研究結(jié)果能為今后深入詮釋ALC影響水牛卵母細(xì)胞成熟過程中生殖生物學(xué)功能相關(guān)研究提供參考。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823.83
【圖文】：

－ｕ－Ｎ－三甲基賴氨酸。３－羥基－６－Ｎ－三甲基賴氨酸醛縮酶（酶３）分裂為３－輕基－６－三甲基賴逡逑氨酸甘氨酸加４－Ｎ－三甲基氨基丁醛進(jìn)一步脫氫制備４－Ｎ－二中氨基Ｔ酸酯（４－三甲氨基丁逡逑醛，也稱ｙ－丁基甜菜堿）脫氫酶（酶４）（圖１－１）。在這個反應(yīng)的酶中，ｙ－丁基甜菜堿羥逡逑化酶是一種不存在于心臟和骨骼肌，而在人肝臟、睪丸和腎臟中高表達(dá)一種酶［６］。素食逡逑者身體中，Ｌ－肉堿（Ｌ－ｃａｍｉｔｉｎｅ，ＬＣ）生物合成率約為１．２（ａｍｏｌ／ｋｇｗｅｉｇｈｔ／ｄ［７１。雜食性動逡逑物的身體中，ＬＣ的合成率為２？１２邋ｐｍｏｌ／ｋｇ邋ｗｅｉｇｈｔ／ｄ，占身體肉堿來源的７５％［８］。腎臟再逡逑吸收和飲食攝入肉堿的變化均不影響內(nèi)源性肉堿合成速率［９］�？诜鈮A的生物利用度只逡逑有１４％到１８％劑量，未被吸收的肉堿大多被大腸中的微生物降解掉［１＜）］。逡逑１逡逑

－ｕ－Ｎ－三甲基賴氨酸。３－羥基－６－Ｎ－三甲基賴氨酸醛縮酶（酶３）分裂為３－輕基－６－三甲基賴逡逑氨酸甘氨酸加４－Ｎ－三甲基氨基丁醛進(jìn)一步脫氫制備４－Ｎ－二中氨基Ｔ酸酯（４－三甲氨基丁逡逑醛，也稱ｙ－丁基甜菜堿）脫氫酶（酶４）（圖１－１）。在這個反應(yīng)的酶中，ｙ－丁基甜菜堿羥逡逑化酶是一種不存在于心臟和骨骼肌，而在人肝臟、睪丸和腎臟中高表達(dá)一種酶［６］。素食逡逑者身體中，Ｌ－肉堿（Ｌ－ｃａｍｉｔｉｎｅ，ＬＣ）生物合成率約為１．２（ａｍｏｌ／ｋｇｗｅｉｇｈｔ／ｄ［７１。雜食性動逡逑物的身體中，ＬＣ的合成率為２？１２邋ｐｍｏｌ／ｋｇ邋ｗｅｉｇｈｔ／ｄ，占身體肉堿來源的７５％［８］。腎臟再逡逑吸收和飲食攝入肉堿的變化均不影響內(nèi)源性肉堿合成速率［９］。口服肉堿的生物利用度只逡逑有１４％到１８％劑量，未被吸收的肉堿大多被大腸中的微生物降解掉［１＜）］。逡逑１逡逑

在內(nèi)的血清代謝物同時存在于卵泡液中，但含量較低［８１］。在ＣＯＣｓ發(fā)育的微環(huán)境里，逡逑即卵泡液中存在著大量的甘油三脂和游離脂肪酸，脂肪酸在ＣＯＣｓ發(fā)育過程中發(fā)揮重要逡逑的作用（圖１－３）。逡逑８曍邐＇’\l邋Ｃ＾ｒ邋＇邋—逡逑Ｏ邋v|邐翁邐■，一，逡逑：：逡逑Ｉ：邋：邐幽邋ｅ＿ｅ＿ｅｒ逡逑ＴｒｉａｃｙｌＱｌｙｃｅｒｏｌ逡逑圖１－３游離脂肪酸在卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體中的利用和分解示意圖［８２］。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐｒｏｐｏｓｅｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ邋ｏｆ邋ｆｒｅｅ逡逑１０逡逑

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本文編號：2744565