【摘要】：2015年7月起,由禽腺病毒血清4型(FAd V-4)中國流行株引起的以剖檢病變主要為心包膜內(nèi)有淺黃色的積液、肝臟黃染、腫大和出血為特征的雞肝炎-心包積液綜合征(HHS)在我國山東、河南、安徽和江蘇等省份大面積流行。該病主要危害3-5周齡肉雞,表現(xiàn)為突發(fā)性死亡,死亡率20%-60%,最高可達80%,為我國養(yǎng)禽業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。本課題組與國內(nèi)其他研究表明,引起此次HHS流行的FAd V-4中國流行株屬于新的基因型,與早期報道的致病性和非致病性的FAd V-4相比,FAd V-4中國流行株的基因組和主要結(jié)構(gòu)基因有較明顯的差異,氨基酸的突變和缺失主要集中在fiber2蛋白。為了客觀準確地監(jiān)測FAd V-4中國流行株在雞群中的流行狀況,本研究從血清學(xué)及分子生物學(xué)方面建立了新型的FAd V-4檢測方法,對雞群進行監(jiān)測,以期為HHS疫情的監(jiān)測防控提供方法。1.禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速檢測方法的建立為了建立一種快速、靈敏、簡便的FAd V-4現(xiàn)場檢測方法,本研究將重組酶聚合酶擴增(RPA)與膠體金側(cè)向流試紙條(LFD)技術(shù)聯(lián)合,設(shè)計針對FAd V-4 hexon基因的特異性RPA引物,上、下游引物的5’端分別進行6-羧基熒光素(FAM)和生物素(Biotin)標記。通過對引物濃度、RPA反應(yīng)時間和溫度等條件的優(yōu)化,建立了一種可用于FAd V-4現(xiàn)場檢測的RPA-LFD方法。該檢測方法在25-45℃恒溫反應(yīng)15 min即可實現(xiàn)對FAd V-4目的基因片段的有效擴增,RPA擴增產(chǎn)物用膠體金側(cè)向流試紙條進行檢測,檢測結(jié)果肉眼可見。該方法的最低檢測限為100拷貝,敏感性是常規(guī)PCR的100倍,且與其他常見禽病病原核酸檢測無交叉反應(yīng)。結(jié)果顯示,本研究建立的RPA-LFD可用于FAd V-4的臨床快速檢測,為FAd V-4感染的流行病學(xué)檢測提供了一種有效方法。2.基于FAd V-4中國流行株fiber2蛋白的間接ELISA抗體檢測方法的建立為了建立用于禽腺病毒血清4型中國流行株的血清流行病學(xué)監(jiān)測方法,本研究利用在大腸桿菌中表達的FAd V-4中國流行株fiber2 C-末端蛋白作為包被抗原,建立了檢測抗FAd V-4中國流行株抗體的間接ELISA方法。所建立方法的優(yōu)化后的最佳條件為:抗原最適包被量為0.25μg/孔,包被時間為37℃1 h,然后4℃過夜;被檢血清的最佳稀釋度為1:800,作用時間為2 h;二抗選用HRP標記的兔抗雞Ig Y,稀釋度為1:4 000,作用時間為1.5 h;顯色液TMB作用條件為室溫5 min。所建立ELISA的判定標準為:樣品的S/P值大于或等于0.0553判為陽性,小于0.0418判為陰性。用建立的ELISA方法對抗雞新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒陽性血清進行了檢測,均無交叉反應(yīng),表明該方法有較好的特異性,組內(nèi)和組間重復(fù)的最大變異系數(shù)為5.6%和5.7%,所建立的ELISA方法重復(fù)性良好。用所建立的ELISA方法對50份來自于疑似患肝炎-心包積液合征病雞的血清樣品進行檢測,陽性檢出率為98%,與FAd V-4病原學(xué)檢測結(jié)果符合率為100%。結(jié)果表明,本研究所建立的ELISA方法可用于抗FAd V-4中國流行株抗體的檢測,為肝炎-心包積液綜合征病監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查提供了方法。3.抗Hexon469-775aa蛋白單克隆抗體的制備及鑒定本研究以純化的FAd V-4全病毒為免疫原免疫小鼠制備單克隆抗體,用I群禽腺病毒hexon保守區(qū)(469-775aa)重組蛋白篩選出4株單克隆抗體。4株單克隆抗體亞類均為Ig G2b,且能夠特異性識別FAd V-4、FAd V-8b、FAd V-11的hexon蛋白,與新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法師囊病毒、禽流感病毒均不發(fā)生特異性反應(yīng)。結(jié)果表明,hexon蛋白469-775aa區(qū)域攜帶有禽腺病毒群特異性抗原,重組hexon469-775aa蛋白和篩選得到的單克隆抗體能夠用來建立多種臨床相關(guān)的禽腺病毒的檢測方法,并為評價禽腺病毒免疫或感染后產(chǎn)生的抗體水平打下基礎(chǔ)。4.禽腺病毒雙抗體夾心ELISA檢測抗原的方法建立本研究以抗hexon469-775aa單克隆抗體為捕獲抗體,對各反應(yīng)條件進行了優(yōu)化,建立了檢測禽腺病毒的雙抗體夾心ELISA方法。所建立的ELISA方法特異性良好,與傳染性法氏囊病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒、減蛋綜合征病毒均無交叉反應(yīng)。批間和批內(nèi)的重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于10%,表明建立的ELISA方法穩(wěn)定性良好。用所建立的雙抗體夾心ELISA方法對50份臨床樣品進行檢測,檢測結(jié)果與禽腺病毒PCR病原檢測結(jié)果相符。結(jié)果表明,本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法可用于臨床禽腺病毒感染情況的監(jiān)測,為我國禽腺病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

室溫存活時間較長，60 ℃加熱 30 min 或者劑如乙醚、氯仿、2%的酚與 5%的乙酸等抵抗力均可被濃度為 0.1%的甲醛滅活，高溫如 60 ℃加熱 1使禽腺病毒滅活，也可被 DNA 抑制劑 5-碘脫氧蛋白及功能組的兩條 DNA 單鏈上，共有 46 個潛在的蛋白質(zhì)s）（正義鏈上的 ORFs 占 57%）。FAdV-4 基因組的，28 個代表屬特異性基因[18]。FAdVs 編碼區(qū)的編鄰體蛋白（hexon）、纖突蛋白（fiber）、pVI、pVfiber 蛋白為 FAdVs 的主要結(jié)構(gòu)蛋白。 5 個多肽相互作用而成，其與 fiber 蛋白以共價鍵正二十面體病毒衣殼的頂端。Fiber 蛋白可分為尾連；桿部一般由 22 個重復(fù)的亞單位構(gòu)成，每個亞圖 1 禽腺病毒粒子結(jié)構(gòu)示意圖Fig1 The vision of FAdV

2 禽腺病毒血清 4 型的流行病學(xué)研究1987 年，巴基斯坦首次暴發(fā)了由 FAdV-4 引起的疾病，其特征是心包膜內(nèi)積累有淡黃色的液體，腎炎，肝炎。因發(fā)病地點靠近巴基斯坦的安加拉地區(qū)，故被稱為“安加拉病”。1994年在印度第一次暴發(fā)了 FAdV-4 引起的 HHS，之后短短的幾個月，該病就傳播到印度的其他地區(qū)。因該病剖檢可見心包膜大量積液，導(dǎo)致眼觀病變心臟與荔枝形態(tài)相似，又被稱為“荔枝病”。隨后，疫情已擴大到其他國家，包括伊拉克，印度，日本，墨西哥，智利，厄瓜多爾，秘魯，俄羅斯，斯洛伐克，孟加拉國，韓國和中國（圖 2）。

3 禽腺病毒的檢測方法3.1 病原的分離鑒定FAdV-4 在感染雞只的肝臟上的含量較高�？梢栽跓o菌條件下，取感染或病死雞只的肝臟組織進行研磨，制成組織懸液，凍融后離心取上清，經(jīng)絨毛尿囊膜或卵黃囊途徑[27]接種SPF 雞胚。雞胚出現(xiàn)死胚、胚胎充血、發(fā)育遲緩，剖檢可見肝臟腫大出血，脾臟腫大，鏡檢可看到肝細胞內(nèi)有嗜堿性或嗜酸性核內(nèi)包涵體[28]。除了通過雞胚接種傳代的方法進行病毒的分離鑒定外，也可以用細胞培養(yǎng)的方法進行病毒的分離鑒定。FAdVs 可在雞胚原代腎細胞（CEK）、雞胚原代肝細胞（CEL）[26, 29]、雞肝癌細胞（LMH）上進行增殖。病毒感染的細胞出現(xiàn)明顯的細胞形態(tài)變化，如細胞變圓，折光性變強，最后脫落。李海英[30]、何秀苗[31]利用 CEK 對分離到的 FAdVI-JS 株進行病毒[32][33]圖 3. 剖檢、組織學(xué)檢查感染 HHS 雞只的心臟、肝臟[26]Fig 3. Postmortem and histological examinations of the liver and heart from affected birds with HHS.A. The accumulation of clear, straw-colored fluid in the pericardial sac and a discolored swollen liver withpinpoint hemorrhage; B. Small multifocal areas of necrosis and basophilic intranuclear inclusion bodies inhepatocytes (H&E stain, original magnification×400, scale bar=50 μm); C. Lymphocytic infiltrates in associationwith myocarditis (H&E stain, original magnification×400, scale bar=50 μm).

【參考文獻】

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本文編號：2743076