【摘要】：豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是1974年發(fā)現(xiàn)的一種無囊膜單股環(huán)狀DNA病毒,分3個(gè)型。豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)對豬無致病性,豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)則可引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)、皮炎和腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫(CT)、壞死性增生性肺炎(PNP)、豬呼吸道綜合征(PRDC)、母豬繁殖障礙等多種豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus-associated desease,PCVAD)。豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的,其致病性及致病機(jī)理仍有待研究。因此,防控PCV2的感染成為了養(yǎng)豬業(yè)的重中之重,其中疫苗免疫是最有效的防控手段之一,疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣便成為能否有效防控的關(guān)鍵。但PCV2商品化疫苗品種眾多,不同類型或不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的疫苗效力檢驗(yàn)方法差異較大,很難形成統(tǒng)一的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。影響疫苗質(zhì)量的因素較多,但對于滅活疫苗或亞單位疫苗而言,抗原含量的多少則成為疫苗優(yōu)劣的最重要指標(biāo)之一,PCV2的衣殼由60個(gè)ORF2編碼的衣殼蛋白組成,這也是PCV2的唯一結(jié)構(gòu)蛋白,具有較好的免疫原性和抗原性,因此針對Cap蛋白的絕對定量方法無疑是一種更具吸引力的方法,這種方法對于評價(jià)疫苗質(zhì)量甚至替代免疫攻毒等效力檢驗(yàn)方法也是非常必要的。本研究以大腸桿菌表達(dá)PCV2 Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,經(jīng)檢測抗體水平取脾臟制備淋巴細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞融合、亞克隆以及間接ELISA篩選,獲得2株雜交瘤細(xì)胞株,命名為7D7和5C2。經(jīng)間接夾心ELISA檢測,均與PCV2全病毒和PCV2 Cap蛋白反應(yīng),且針對不同的抗原表位,其中7D7的反應(yīng)性更好。經(jīng)SDS-PAGE,Western Blot檢測結(jié)果顯示7D7和5C2不僅能特異性識別大腸桿菌表達(dá)PCV2 Cap蛋白(約26 kDa),也能特異性的與桿狀病毒表達(dá)PCV2 Cap蛋白(約30 kDa)反應(yīng),且為線性表位。單克隆抗體亞型間接ELISA結(jié)果顯示兩株單抗均為IgG2a亞型。鑒于7D7的反應(yīng)性較好,因此,用改良的過碘酸鈉法對單抗7D7進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記,形成酶標(biāo)單抗7D7-HRP。以單克隆抗體7D7作為捕獲抗體,7D7-HRP為檢測抗體,成功建立了檢測PCV2抗原的單克隆抗體夾心ELISA方法,該方法以桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白為標(biāo)準(zhǔn)抗原,線性范圍是0.1096 ng/mL-14.2222 ng/mL,相關(guān)系數(shù)0.99,變異系數(shù)10%,回收率在90%以上,且與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)等多種病毒抗原無交叉反應(yīng)。對13個(gè)廠家的豬圓環(huán)病毒疫苗進(jìn)行了檢測,顯示不同企業(yè)疫苗抗原含量差異明顯,13家疫苗中有7家疫苗的抗原含量超過了本方法的上限值,6家疫苗的檢測值處于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi),其中1家疫苗的抗原含量較低,與抗原含量高者相差至少20倍。綜上所述,本研究成功篩選了2株針對不同線性表位的PCV2單克隆抗體,為進(jìn)一步研究PCV2抗原表位分布及特性提供了實(shí)驗(yàn)材料。建立了背景值低,特異性好,靈敏性強(qiáng),準(zhǔn)確度高的用于PCV2抗原含量測定的單克隆抗體夾心ELISA方法,為PCV2疫苗生產(chǎn)工藝研究和質(zhì)量控制以及傳統(tǒng)疫苗效檢方法替代方法的研究奠定了基礎(chǔ),也為目前解決PCV2疫苗品種多、生產(chǎn)企業(yè)多、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,監(jiān)管難度大提供了技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：

的 PCV2 Cap 蛋白；2：原 2-1 抗原的 SDS-PAGE 鑒測定2 Cap 蛋白，用間接 ELIS清中抗體效價(jià)大于 12800 2-1 小鼠 ELISA 抗體效價(jià)OD450待檢血清 小鼠陰性血1.5011 0.0681 1.3641 0.0587 1.1769 0.0606 1.0580 0.0490 0.8670 0.0491 0.6320 0.0523 0.3570 0.0508

國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學(xué)位論文 第二章 單克隆抗體的制備與特性研.4.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 按常規(guī)方法融合后，用間接 ELISA 方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞限稀釋法進(jìn)行 3 次亞克隆后最終獲得 2 株可穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為 7D 5C2（表 2-2 和圖 2-2）。表 2-2 雜交瘤細(xì)胞的篩選7D7 5C2 陰性血清第 1 次 0.5732 0.4686 0.0523第 2 次 1.1313 1.0704 0.0587第 3 次 1.2255 1.1864 0.0490

M：Marker 1：BSA（66 KDa） 2：7D7 3：5C圖 2-3 兩株單克隆抗體的 SDS-PAGE 鑒定的鑒定亞型鑒定顯示，單克隆抗體 7D7 和 5C2 均為 IgG2a 亞型。

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本文編號：2743033