【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的慢性消耗性、人畜共患的傳染性疾病。每年全球約有1千萬病例感染結(jié)核桿菌,約有300萬人死于結(jié)核病。如今結(jié)核病的出現(xiàn)不僅對人類健康造成了巨大的威脅,也嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,特別是耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)�？菇Y(jié)核化學(xué)藥物用于臨床治療結(jié)核病已有數(shù)十年,而用藥不合理、艾滋病的流行等原因,導(dǎo)致了耐藥結(jié)核菌的產(chǎn)生使結(jié)核病的治療更加困難。因此,本研究通過使用異煙肼(Isonicotinic acid hydrazide,INH)藥物對標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)行不同梯度的誘導(dǎo),對耐藥菌株與巨噬細(xì)胞作用后對感染相關(guān)主要細(xì)胞因子的影響及免疫逃逸的初步研究。對標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和本實驗室分離的野毒株進(jìn)行異煙肼藥物最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)值測定。以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的MIC值作為標(biāo)準(zhǔn),分別用1/8MIC、1/2MIC、1/4MIC、MIC、2MIC和4MIC對H37Rv進(jìn)行誘導(dǎo),對誘導(dǎo)后菌株進(jìn)行MIC值測定,測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的MIC進(jìn)行比較,誘導(dǎo)后菌株的MIC值與H37Rv相比變大,且誘導(dǎo)菌株用藥濃度越大則MIC越大。將標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv,野毒株與不同梯度誘導(dǎo)的菌株感染RAW264.7巨噬細(xì)胞,應(yīng)用CCK-8法檢測感染后的細(xì)胞增殖狀況,應(yīng)用ELISA方法和熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明細(xì)胞增殖在前8h增加,在8h時達(dá)到最大,8h后細(xì)胞增殖量下降,不同毒力菌株感染細(xì)胞后細(xì)胞因子的分泌量和轉(zhuǎn)錄水平都呈現(xiàn)上升趨勢,且MIC、2MIC和4MIC誘導(dǎo)菌株的表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄水平高于其他誘導(dǎo)菌株。結(jié)核分枝桿菌感染RAW264.7細(xì)胞后能夠引起MAPK等通路的激活或抑制,本文通過western blot對MAPK通路中的p38、JNK和ERK以及磷酸化蛋白含量進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的蛋白表達(dá)量高于誘導(dǎo)菌株和野毒株,且低濃度藥物誘導(dǎo)菌株的蛋白表達(dá)量高于高濃度藥物誘導(dǎo)菌株。通過用NF-κB活化抑制劑對巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理后,應(yīng)用Griess法檢測巨噬細(xì)胞在不同時間點NO的分泌情況和NF-κB蛋白含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NO分泌量和NF-κB蛋白含量整體上升,然后隨時間的增加后降低,無抑制劑時在8h和4h時表達(dá)量最高,加入抑制劑后表達(dá)量最高的時間點有所推遲。誘導(dǎo)菌株的NO分泌量和NF-κB蛋白含量低于H37Rv菌株,誘導(dǎo)梯度越高表達(dá)量越低,野毒株和4MIC誘導(dǎo)菌株的表達(dá)量相近。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

1.3 結(jié)果1.3.1 抗酸染色結(jié)果將采集的菌株進(jìn)行抗酸染色結(jié)果見圖1.1。圖1.1抗酸染色結(jié)果Fig.1.1 The results of acid resistant dying1.3.2 熒光定量PCR結(jié)果提取采集的 237 組織樣品基因組，利用通用型引物 16S 及探針對提取的基因組進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測，見圖 1.2，共檢出結(jié)核菌陽性 41 份，總陽性率為 17.3 %。不同地點（長春 12 份、松原 8 份、吉林 11 份和通化 10 份）、不同性別（公鹿 24 份和母鹿 17 份）及不同年齡（仔鹿 8 份、育成鹿 16 份和成年鹿 17 份）的梅花鹿均存在結(jié)核分枝桿菌感染情況。結(jié)果見表 1-6 所示：

圖 1.2 16S 通用引物熒光定量 PCR 檢測結(jié)果Fig.1.2 Results of Fluorescence quantitative PCR by 16Sprimr表 1-6 熒光定量 PCR 檢測結(jié)果Tab.1-6 The results of Fluorescence quantitative PCR因素 檢測樣本 陽性樣本 陽性率（%）地點長春 67 12 17.91松原 51 8 15.69吉林 62 11 17.74通化 57 10 17.54性別公鹿 128 24 18.75母鹿 109 17 15.6年齡仔鹿 59 8 13.56育成鹿 92 16 17.39成年鹿 86 17 19.77

合計 237 41 17.31.3.3 菌株誘導(dǎo)生長和MIC值測定結(jié)果結(jié)核分枝桿菌在羅氏培養(yǎng)基上生長形狀為菜花樣，見圖1.3，在7H9液體培養(yǎng)基中生長為米白色顆粒并且有菌膜生成，見圖1.4，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和野毒株進(jìn)行藥物異煙肼MIC測定，分別為0.196mg/mL和1.562mg/mL見圖1.5和1.6。則進(jìn)行誘導(dǎo)的1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC的濃度分別為0.025、0.049、0.098、0.196、0.392和0.784mg/mL。將MIC誘導(dǎo)菌株和4MIC誘導(dǎo)菌株進(jìn)行MIC測定，它們MIC值分別為3.125mg/mL和12.5mg/mL，見圖1.7和1.8。

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本文編號：2743318