【摘要】：目的對(duì)豬圓環(huán)病毒3型遼寧分離株(LN-PCV3)的分子特征進(jìn)行分析,并依據(jù)廣泛流行的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的重大經(jīng)濟(jì)損失,特別是二者混合感染,帶來(lái)更大經(jīng)濟(jì)損失的現(xiàn)狀,本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別構(gòu)建了表達(dá)PCV3 Cap基因的單聯(lián)疫苗和融合表達(dá)PCV2和PCV3 Cap蛋白基因的二聯(lián)疫苗,并對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)估,為PCV2和PCV3的綜合防治儲(chǔ)備了物質(zhì)基礎(chǔ)。方法參照湖北分離株HB-PCV3-2016(GenBank登錄號(hào):KY954038.1)設(shè)計(jì)特異性引物,以PCR檢測(cè)PCV3陽(yáng)性的樣品為模板,對(duì)全基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后,與pMD-18-T載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中,篩選得到的陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取,進(jìn)行酶切鑒定,酶切鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的基因序列用Mega7.0和DNAStar軟件進(jìn)行分析,與GenBank公布的PCV3其他分離株基因序列進(jìn)行比對(duì)和分子特性分析。在此基礎(chǔ)上,分別選取PCV2疫苗株P(guān)CV2-SH(登陸號(hào):HM038027.1)的Cap蛋白基因和LN-PCV3的Cap蛋白基因,用剛性連接肽Linker將PCV2 Cap蛋白基因與PCV3 Cap蛋白基因進(jìn)行連接融合,作為免疫原基因。根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛(ài)性、對(duì)免疫原基因進(jìn)行人工修飾、優(yōu)化和合成,獲得免疫原基因PCV2-3-Cap,并克隆至pMD-18-T載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒T-PCV2-3-Cap。分別以優(yōu)化后的PCV3-Cap蛋白基因和PCV2-3-Cap融合蛋白基因?yàn)榘谢?設(shè)計(jì)特異性引物,以T-PCV2-3-Cap為模板,擴(kuò)增PCV3-Cap和PCV2-3-Cap蛋白基因,轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中,篩選得到的陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取,進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的PCV3-Cap基因和PCV2-3-Cap融合基因克隆至pFastBac 1載體上,分別構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap。將pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap分別轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)座,經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選后,提取重組桿粒,并轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細(xì)胞,通過(guò)篩選獲得表達(dá)PCV3 Cap基因與共表達(dá)PCV2和PCV3 Cap融合基因的重組桿狀病毒,經(jīng)PCR,SDS-PAGE,Western blot,免疫熒光,電鏡等實(shí)驗(yàn)方法鑒定正確后,用蔗糖密度離心法對(duì)病毒進(jìn)行純化。所得的純化病毒作為免疫原,以1x10~8pfu的重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap免疫BALB/c小鼠,并設(shè)免疫對(duì)照組,每隔2周進(jìn)行一次免疫,連續(xù)免疫三次,分別在首免后0d,14d,28d,42d對(duì)小鼠尾部進(jìn)行采血并分離血清。用ELISA方法檢測(cè)PCV2和PCV3的抗體水平。首免后42d,處死小鼠摘取脾臟,通過(guò)CCK-8法計(jì)算各免疫組之間小鼠的淋巴細(xì)胞增值指數(shù)SI。按照細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的使用方法,對(duì)免疫小鼠的IL-2,IL-4,IFN-γ等細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè),從而驗(yàn)證PCV3-Cap蛋白基因、PCV2-3-Cap融合蛋白基因在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)效果及其免疫原性。結(jié)果通過(guò)PCR方法從PCV3陽(yáng)性樣品中,克隆到PCV3全基因序列,長(zhǎng)度為2000bp,命名為L(zhǎng)N-PCV3(GenBank登錄號(hào):MH177453.1)。遺傳進(jìn)化樹(shù)分析顯示,我國(guó)目前流行的PCV3分離株可形成3個(gè)分支(3a簇、3b簇與3c簇),LN-PCV3株處于3a簇分支中,與湖北株HB-PCV3-2016(GenBank登錄號(hào):KY354039.1)同源性最高,達(dá)到99.7%。在此基礎(chǔ)上,將構(gòu)建的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap,分別轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)座后,PCR交叉檢驗(yàn)證明獲得重組桿粒rAcBacmid-PCV3-Cap和rAcBacmid-PCV2-3-Cap。然后將重組桿粒轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細(xì)胞,制備重組桿狀病毒,重組桿狀病毒連續(xù)傳代3次,傳代3次(P3代)重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap經(jīng)透射電鏡觀察,可見(jiàn)假病毒粒子和桿狀病毒粒子。用M13通用引物、PCV3-Cap基因特異引物、PCV2-3-Cap基因特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可見(jiàn)674bp與2974bp,1514bp與3814bp處出現(xiàn)目的片段,大小均與理論值一致。分別通過(guò)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè),在30kD與55kD處出現(xiàn)目的條帶。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn),兩組重組蛋白在熒光顯微鏡下均出現(xiàn)綠色熒光,正常細(xì)胞未出現(xiàn)熒光效果,證明PCV3-Cap基因、PCV2-3-Cap融合基因在SF9細(xì)胞中獲得表達(dá),并且成功篩選到重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap�？贵w水平檢測(cè)結(jié)果表明,rvAc-PCV3-Cap和rvAc-PCV2-3-Cap免疫組PCV3抗體水平均明顯高于PBS陰性對(duì)照組與PCV2滅活苗陽(yáng)性對(duì)照組,差異顯著(P0.05),但rvAc-PCV3-CAP和rvAc-PCV2-3-Cap免疫組間PCV3抗體水平差異不顯著(P0.05)。rvAc-PCV2-3-Cap免疫組PCV2抗體水平均明顯高于PBS陰性對(duì)照組和rvAc-PCV3-Cap組,差異顯著(P0.05),但與PCV2滅活苗陽(yáng)性對(duì)照組相比,抗體水平差異不顯著(P0.05)。CCK-8法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增值指數(shù)(SI)的結(jié)果顯示,rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap免疫組、PCV2滅活苗陽(yáng)性對(duì)照組均與PBS組相比,SI值差異顯著(P0.05),但其他三個(gè)免疫組間相比,差異并不顯著(P0.05)。細(xì)胞因子水平檢測(cè)表明,證明注射重組桿狀病毒組能夠刺激機(jī)體提高IL-2,IL-4,IFN-γ的分泌水平,與PCV2滅活苗組差異不顯著(P0.05),但明顯高于PBS陰性對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論1.成功對(duì)LN-PCV3進(jìn)行了全基因克隆,并對(duì)其分子生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。2.利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了PCV3 Cap蛋白基因和PCV2、PCV3 Cap蛋白融合基因的表達(dá),并成功篩選到了重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap。3.小鼠免疫實(shí)驗(yàn)表明重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,為豬圓環(huán)病毒新型疫苗研制提供了技術(shù)支持和物質(zhì)儲(chǔ)備。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

L/well 加入 TMB，37℃避光孵育 30min。100μL/well 加入迅速加入 Stop solution 終止長(zhǎng) 450nm 讀值。定制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算 IL-4 的濃度。結(jié) 果毒 3 型全基因克隆及分子特性研究N 株全基因克隆結(jié)果V3 的陽(yáng)性病料用已經(jīng)設(shè)計(jì)好的全基因引物進(jìn)與理論值相符。(圖 1) 。

圖 2 T-PCV3 陽(yáng)性質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果A Marker DL5000；1.PCV3 基因酶切 2.陰性對(duì) 的分子特性研究源性分析結(jié)果顯示 PCV3 可分為 3 大分支 LN-PCV3 與 USMO-PC-PCV3-2017,SH-PCV3-2016 同屬與 3a 簇性最高，達(dá)到 99.7%，與其他 3a 簇同源性在 株基因的同源性在 98.4%～99.7%之間同源性為 98.3%（如圖 3，圖 4 所示）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉長(zhǎng)明,陸月華,張超范,危艷武,劉煥章,童光志;豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá)[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2005年06期

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1 張家明;豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及亞單位疫苗的初步研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2742941