【摘要】：豬圓環(huán)病毒(Porcine circoviru,PCV)是圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬的成員,分為PCV1和PCV2兩個血清型。PCV1不致病,但PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、先天性震顫和豬皮炎腎炎綜合征等多種疾病,急性暴發(fā)時豬群的死亡率可達50%,對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)危害嚴重。在PCV1與PCV2的基因組中約含有11個開放閱讀框(ORF),PCV的復(fù)制蛋白Rep由ORF1編碼,病毒衣殼蛋白Cap主要由ORF2基因編碼。ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白Cap是病毒主要的保護性抗原,與病毒免疫機制關(guān)系緊密,是臨床研制PCV亞單位疫苗的首選蛋白。乳酸乳球菌由于自體分泌的外源蛋白少,作為亞單位疫苗的宿主載體,重組菌具有可以直接飼喂不需純化的優(yōu)點。本實驗將以乳酸乳球菌作為宿主菌,利用p H誘導(dǎo)型表達載體p AMJ399構(gòu)建表達Cap蛋白的重組乳酸乳球菌。該菌株在發(fā)揮乳酸菌益生作用的同時亦可表達Cap蛋白,作為防制豬圓環(huán)病毒病的重組亞單位活載體疫苗,為PCV新型口服疫苗的研究提供新思路。本實驗通過PCR擴增獲得了含有兩個酶切位點Bgl II和Pst I并去除核定位信號序列的PCV2 Cap基因片段約579 bp,將Cap基因與乳酸乳球菌表達質(zhì)粒p AMJ399連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)TG1中,獲得重組質(zhì)粒p AMJ399-Cap,再將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài)細胞MG1363中,獲得重組乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363。SDS-PAGE檢測可見誘導(dǎo)后的重組菌p AMJ399-Cap/MG1363在約28 k Da處出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果大小相符合的目的帶,以PCV2單克隆抗體3C11上清進行Western blot檢測,可見重組菌p AMJ399-Cap/MG1363在約28 k Da處出現(xiàn)了特異性的反應(yīng)帶,表明Cap蛋白在重組乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363中獲得了表達。間接免疫熒光實驗和ELISA檢測結(jié)果表明表達的Cap蛋白即可分泌于培養(yǎng)液中,同時也分布于菌體表面。對構(gòu)建的重組乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363進行生物安全性評價。通過重組菌在模擬消化道環(huán)境中的生存性能以及口服后在消化道內(nèi)的存留情況分析,結(jié)果顯示重組菌在p H3.5的胃液環(huán)境下作用5 h存活率為63.09%,在腸液環(huán)境下重組菌可存活24 h以上,對5%的鹽濃度具有較好的耐受能力。單次灌胃重組菌后4 h,小鼠空腸和結(jié)腸均檢測到較強的重組菌存留信號,熒光強度顯著高于對照組;8 h時,各腸段熒光信號均較弱,表明重組菌存留較少;連續(xù)灌胃4天,在第5 d檢測時,重組菌在空腸、回腸和結(jié)腸各腸段均有明顯的熒光信號,表明均有重組菌的存留,而在檢測的第6 d和11 d,除空腸和回腸沒有熒光信號外,結(jié)腸均有明顯的熒光信號,可見重組菌可在腸道內(nèi)存留10天以上。為進一步探討重組乳酸乳球菌的免疫效果,本實驗以小鼠作為實驗動物,進行口服免疫。實驗共分為3組:實驗組口服免疫重組菌p AMJ399-Cap/MG1363,劑量4×107CFU/只;對照組分為空載體組與PBS組,分別口服免疫空載體菌p AMJ399/MG1363,劑量4×107 CFU/只和相同體積的PBS。免疫程序為:免疫兩次,每次免疫間隔2周,每次連續(xù)免疫3天,每天免疫一次。在免疫前和免疫后不同時間收集糞便、血清和腸黏液樣品,分別通過ELISA方法檢測糞便中特異性s Ig A水平、血清中特異性Ig G水平和腸黏液中特異性s Ig A水平。結(jié)果顯示,重組菌口服免疫小鼠,可以提高小鼠的日采食量,增加日增重量;免疫重組菌p AMJ399-Cap/MG1363的小鼠s Ig A和Ig G水平均高于對照組,表明口服乳酸乳球菌既可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生局部的黏膜免疫應(yīng)答,又可刺激機體產(chǎn)生系統(tǒng)的體液免疫應(yīng)答。IL-4和IFN-γ兩種細胞因子的檢測結(jié)果表明,重組菌組和空載體組在免疫后有明顯升高趨勢,與PBS組相比,差異顯著。表明在免疫重組菌后既可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答也可以產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。本實驗構(gòu)建的重組乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363可穩(wěn)定表達PCV2 Cap蛋白并具有良好的安全性,口服免疫可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。本研究為重組乳酸乳球菌口服疫苗防制豬圓環(huán)病毒病奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651
【圖文】：

A Maker DL2000；1、2.目的基因的 PCR 擴增產(chǎn)物； DL2000;Lane 1、2:PCR product of target gene;Lane 圖 3-1 目的基因片段 Cap 的 PCR 擴增結(jié)果 Gelelectrophoresis result of cap gene amplifieD19-T-Cap 的鑒定結(jié)果基因 Cap 片段，經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠純化，純D19-T-Cap 重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行單酶切）、雙酶切鑒定得到約 2692 bp 和 579 bp 基因（圖 3-5），進一步測序鑒定（結(jié)果見附錄）相符。

Trans2K Plus II；1：重組質(zhì)粒 pMD19lus II;Lane 1: The recombinant plasmi組質(zhì)粒 pMD19-T-Cap Pst I 單酶cation result of pMD19-T-Cap by rans2K Plus II；1：重組質(zhì)粒 pMD19

【參考文獻】

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本文編號：2741208