【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的人畜共患病原微生物,一定條件下可引起人和動物的多種疾病。雞和豬肉中產(chǎn)氣莢膜桿菌的污染已經(jīng)在世界范圍內(nèi)報道過,但是在鴨產(chǎn)品中卻很少被報道,為了調(diào)查山東省泰安市某市場零售鴨產(chǎn)品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染狀況以及分離株的血清型分布、耐藥性和遺傳演化規(guī)律,2018年3月至11月從零售市場主要的鴨產(chǎn)品零售商店采集鴨產(chǎn)品173份,環(huán)境樣品10份,健康攤主的新鮮糞便7份。采集的樣品經(jīng)分離培養(yǎng)和初步鑒定后,用多重PCR鑒定分離株的血清型,通過紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測了分離株對12種(8類)常用抗菌藥物的敏感性,并根據(jù)耐藥表型檢測了β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和四環(huán)素耐藥基因Tet(M)、TetA(P)、TetB(P)。用16SrDNA對不同來源的部分菌株的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了初步分析,并利用多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)進(jìn)一步分析了不同來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌的遺傳相關(guān)性。分離培養(yǎng)結(jié)果顯示:鴨產(chǎn)品,環(huán)境和健康人類糞便樣品的產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性率分別為(48/173,27.70%),(10/10,100%)和(7/7,100%),共計分離到99株產(chǎn)氣莢膜梭菌;血清型鑒定結(jié)果顯示:所有分離株株均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌;部分菌株16SrDNA序列分析結(jié)果顯示:與NCBI上已上傳的產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌株序列的同源性為99%。毒素基因檢測結(jié)果顯示:在鴨源菌和人源菌中均檢測到cpb2基因,陽性率分別為54.30%和33.33%,所有分離株均未檢測到NetB毒素基因;腸毒素基因cpe只在人源菌株中檢測到,陽性率為(1/7,14.30%)。藥敏實驗結(jié)果顯示:90.10%的鴨源和環(huán)境分離株表現(xiàn)為多重耐藥,耐藥譜中主要包括磺胺異VA唑、桿菌肽、慶大霉素、林可霉素、紅霉素、青霉素和四環(huán)素,鴨源分離株對頭孢噻肟、頭孢吡肟的耐藥率均小于10%。在鴨源和環(huán)境分離株中檢測到四環(huán)素耐藥基因TetA(P)、Tet(M)和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M,陽性率分別為(34.60%,28/81)、(22.20%,18/81)、(4.90%,4/81);在人源菌中只檢測到四環(huán)素耐藥基因TetA(P),陽性率為(66.70%,12/18)。經(jīng)過初步篩選,58株不同來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌被用于多位點序列分型(MLST),20組從NCBI上下載的健康兒童腸道分離株ST序列(ST45-ST64)也被用于分型。分型結(jié)果顯示:58株產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生了41個ST型和4個克隆復(fù)合群(CC1-CC4),4個克隆群占總菌株數(shù)的37.9%,其中CC1包括來自于四個零售商的腸內(nèi)容物分離株、胴體分離株以及環(huán)境分離株,共計14個菌株,占總菌株的24.13%,是一個優(yōu)勢克隆復(fù)合群,其中又以ST11型最為常見,占總菌株的8.60%;部分人源分離株和鴨源分離株被分配在同一ST型(ST6)中。添加了ST45-ST64后,產(chǎn)生了3個新的克隆復(fù)合群(CC5-CC7),鴨源分離株和兒童分離株同時被分配到同一克隆群中。結(jié)論:泰安市鴨產(chǎn)品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染率較高,鴨源和環(huán)境分離株均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌且分離株表現(xiàn)出廣譜耐藥性,多重耐藥率高達(dá)90.10%;45株鴨源和環(huán)境分離株表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性,產(chǎn)生了33個ST型和4個克隆復(fù)合群(CC1-CC4);MLST結(jié)果顯示:可能存在交叉污染,并且零售商環(huán)境和鴨腸內(nèi)容物是導(dǎo)致胴體污染的主要原因;鴨源、人源宿主的部分菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相近,被分配同一個ST型或克隆群中,表明鴨源菌存在通過食物鏈傳播給人類的風(fēng)險。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS251.7;S852.61
【圖文】：

圖 2：產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株多重 PCR 電泳圖；M:DL2000Marker；1：NCTC528；2：NCTC3180；3：NCTC8346；4：NCTC8084；5-18：產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株；19：空白對照ig.2: Multiplex PCR amplification of Clostridium perfringens isolates M: DL2000Marker; 1: NCTC52: NCTC3180 ; 3: NCTC8346; 4: NCTC8084; 5 -18: Clostridium perfringens isolates; 19: blank contro氣莢膜梭菌分離株 cpb2 毒素基因檢測鑒定為陽性的 99 株產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，用 PCR 方法擴(kuò)增分離株的 cpbR 結(jié)果顯示：陽性對照和部分分離株成功擴(kuò)增出了大小為 576bp 的條帶條帶（圖 3）；在 52 株（64.20%）鴨源和環(huán)境分離株中檢測到 cpb2 毒30%）人源分離株中檢測到 cpb2 毒素(表 3）；擴(kuò)增完成后，將 PCR 產(chǎn)測序結(jié)果顯示：與 NCBI 上已上傳的產(chǎn)氣莢膜梭菌 cpb2 序列 Closs strain JGS1984 beta2 toxin (cpb2) gene（登錄號：AY609174.1）的同源M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

圖 2：產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株多重 PCR 電泳圖；M:DL2000Marker；1：NCTC528；2：NCTC3180；3：NCTC8346；4：NCTC8084；5-18：產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株；19：空白對照ig.2: Multiplex PCR amplification of Clostridium perfringens isolates M: DL2000Marker; 1: NCTC5: NCTC3180 ; 3: NCTC8346; 4: NCTC8084; 5 -18: Clostridium perfringens isolates; 19: blank contr氣莢膜梭菌分離株 cpb2 毒素基因檢測鑒定為陽性的 99 株產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，用 PCR 方法擴(kuò)增分離株的 cpR 結(jié)果顯示：陽性對照和部分分離株成功擴(kuò)增出了大小為 576bp 的條帶帶（圖 3）；在 52 株（64.20%）鴨源和環(huán)境分離株中檢測到 cpb2 毒0%）人源分離株中檢測到 cpb2 毒素(表 3）；擴(kuò)增完成后，將 PCR 產(chǎn)測序結(jié)果顯示：與 NCBI 上已上傳的產(chǎn)氣莢膜梭菌 cpb2 序列 Clos strain JGS1984 beta2 toxin (cpb2) gene（登錄號：AY609174.1）的同源M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2741087