【摘要】：奶牛乳腺炎是困擾奶牛健康養(yǎng)殖的重要疾病。金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起奶牛乳腺炎最主要的病原菌之一。目前對奶牛乳腺炎常用的治療方法是抗生素療法。由于抗生素在治療奶牛乳腺炎中具有多種缺點(diǎn),如治愈率低,易殘留等。奶牛養(yǎng)殖業(yè)急切需求抗生素替代品的應(yīng)用�？咕囊蚱錃⒕V廣、無殘留和多靶點(diǎn)殺菌等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是未來抗生素替代品最有力的候選者之一。然而,目前有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌也可以產(chǎn)生抗菌肽耐藥性。但是細(xì)菌獲得可遺傳抗菌肽耐藥性的機(jī)制還不清楚�？咕哪退幮詥栴}已成為阻礙抗菌肽大規(guī)模應(yīng)用的重要因素。因此,進(jìn)行抗菌肽耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的基礎(chǔ)性研究已迫在眉睫。本研究首先評價(jià)了抗菌肽治療金葡菌乳腺炎的效果,然后體外研究了金葡菌產(chǎn)生抗菌肽耐藥性的機(jī)制,以期為抗菌肽在畜牧業(yè)的合理使用及降低細(xì)菌抗菌肽耐藥的產(chǎn)生提供科學(xué)依據(jù)。本研究主要取得以下結(jié)果:1.抗菌肽對牛奶源金葡菌體外殺菌特性的研究。以牛奶來源的金葡菌為試驗(yàn)菌株,研究菌絲霉素源的抗菌肽(NZ2114和MP1102)在培養(yǎng)基、牛奶和奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的殺菌效果,并選用常規(guī)抗生素四環(huán)素作為對照。結(jié)果表明8株牛奶來源的金葡菌對兩種抗菌肽均敏感;兩種抗菌肽在牛奶和奶牛乳腺上皮細(xì)胞中具有對金葡菌E48的高效殺菌能力,且效果優(yōu)于四環(huán)素處理組。整體結(jié)果表明抗菌肽NZ2114和MP1102具有治療奶牛金葡菌乳腺炎的潛力。2.體內(nèi)檢測抗菌肽治療金葡菌乳腺炎的效果。本研究首先通過牛奶源金葡菌誘導(dǎo)了小鼠乳腺炎模型,然后據(jù)此評估了抗菌肽(NZ2114和MP1102)在體內(nèi)乳腺環(huán)境中的殺菌及抗炎效果。結(jié)果表明:經(jīng)過抗菌肽或四環(huán)素治療后乳腺組織中金葡菌的數(shù)量顯著下降,且抗菌肽的效果要好于抗生素(四環(huán)素、NZ2114和MP1102分別下降了1.48、2.9和3.15 log_(10)單位的金葡菌數(shù)量);兩種抗菌肽均能抑制組織中促炎因子IL-6和TNF-α的急劇升高,緩解由金葡菌引起的炎癥反應(yīng)。3.耐抗菌肽金葡菌的誘導(dǎo)及其耐藥分子機(jī)制的研究。金葡菌經(jīng)過抗菌肽35天的持續(xù)誘導(dǎo)后其耐藥性大幅提升。然后在經(jīng)過10天無抗培養(yǎng)基的連續(xù)傳代,金葡菌仍具有抗菌肽耐藥性,其中NZ2114對金葡菌BA01611和Mu50的最小抑菌濃度分別上升到原來的32倍和16倍,Nisin對金葡菌BA01611和Mu50的最小抑菌濃度分別高于原來的4倍和2倍。此結(jié)果表明,抗菌肽的持續(xù)誘導(dǎo)會導(dǎo)致金葡菌獲得可遺傳的抗菌肽耐藥性。通過對耐藥菌的全基因組測序和功能分析,發(fā)現(xiàn)耐藥菌株中多個(gè)基因發(fā)生突變。其中ndh基因在多株耐藥菌中都發(fā)生了突變,其編碼細(xì)菌膜結(jié)合呼吸酶,參與電子鏈的傳遞與活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生。通過對其中一株耐藥菌BA01611~(nzR)中所有突變基因進(jìn)行回補(bǔ),結(jié)果發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)菌的抗菌肽耐藥性均發(fā)生不同程度下降。此結(jié)果說明,耐藥菌株中的基因突變對其抗菌肽耐藥性的變化具有重要作用。4.ROS在金黃色葡萄球菌抗菌肽耐藥性產(chǎn)生中的作用研究。我們通過熒光探針標(biāo)記的方法測定了抗菌肽處理金葡菌后其胞內(nèi)ROS含量的變化,并進(jìn)一步測定了細(xì)菌的利福平突變率變化。結(jié)果表明抗菌肽處理后,金葡菌中ROS的含量明顯上升,ROS引起了細(xì)菌利福平突變率增加,在一定濃度范圍內(nèi),兩者之間存在顯著的線性關(guān)系(R~2=0.7702)。無氧和缺乏鐵離子的環(huán)境中抗菌肽的刺激不會引起細(xì)菌利福平突變率的升高,且鐵離子穩(wěn)態(tài)失衡菌株BA01611Δfur在無抗菌肽刺激時(shí)其利福平突變率顯著高于抗菌肽處理的野生株。這些結(jié)果說明,ROS在金葡菌抗菌肽耐藥性產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用。綜上所述,本研究首先表明抗菌肽有應(yīng)用到治療奶牛金葡菌乳腺炎中的潛力。其次,在探究金葡菌抗菌肽耐藥的產(chǎn)生機(jī)制時(shí),鑒定出多個(gè)新的與抗菌肽耐藥性相關(guān)的突變基因;證明了ROS在金葡菌抗菌肽耐藥性進(jìn)化中具有重要作用。此外,研究結(jié)果還提示在未來使用抗菌肽時(shí)可以聯(lián)合鐵離子螯合劑共同使用,以降低細(xì)菌的突變率進(jìn)而阻礙抗菌肽耐藥性的產(chǎn)生。最終,本研究以期為抗菌肽在畜牧業(yè)的合理使用及降低細(xì)菌抗菌肽耐藥性的產(chǎn)生提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23
【圖文】：

途徑會引發(fā)金葡菌感染：一，當(dāng)皮膚、粘膜表層出現(xiàn)破損時(shí)或手術(shù)切口、導(dǎo)管插入口時(shí)，此時(shí)金葡菌很容易進(jìn)入到皮下組織中，導(dǎo)致感染的發(fā)生；二，當(dāng)機(jī)體免疫力較弱時(shí)，金葡菌可以通過呼吸系統(tǒng)進(jìn)入組織內(nèi)繼而引發(fā)感染，如肺炎等。金葡菌感染后，一般其能存活于細(xì)胞外的血液、淋巴液和組織液中，甚至能夠存活在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。如在奶牛的金葡菌乳腺炎中，金葡菌能侵入到奶牛的乳腺上皮細(xì)胞中(Bayles et al. 1998)。金葡菌侵染宿主細(xì)胞的機(jī)制十分復(fù)雜，包括：粘附于宿主細(xì)胞胞外基質(zhì)；躲避吞噬細(xì)胞的殺菌和溶菌作用，逃避宿主的免疫應(yīng)答；產(chǎn)生和釋放毒素或其他活性物質(zhì)，最后引發(fā)宿主細(xì)胞的損害或死亡(Fraunholz and Sinha 2012)。金葡菌能夠粘附在細(xì)胞外基質(zhì)和血漿蛋白上，是金葡菌侵染宿主細(xì)胞的第一步。當(dāng)金葡菌與宿主細(xì)胞相接觸時(shí),其通過其表面的黏附素與宿主的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，促使細(xì)菌粘附到細(xì)胞上(Foster et al. 2014)。介導(dǎo)此過程的細(xì)菌粘附素主要包括以下幾種（圖 1-1）：一，與細(xì)胞壁錨定在一起的粘附素，如識別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組分（MSCRAMMs）；二，可以跨膜的粘附素，如彈性蛋白結(jié)合蛋白（Ebp）；三，非蛋白質(zhì)性（脂性）核糖磷壁酸, 如細(xì)胞壁磷壁酸（WTAs）；四，未于細(xì)胞壁結(jié)合（分泌或可溶性）的粘附素，如金葡菌胞外粘附蛋白等。

參與殺菌還存在較大爭議(Keren et al. 2013)，但關(guān)于致的。與清除有氧代謝過程中通過連續(xù)的單電子還原在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)氫（H2O2）和具有高度破壞性的羥基自由基（ OH）等會很容易的擴(kuò)散到微生物細(xì)胞中，并和許多細(xì)胞中的生要的是 O2和黃素酶的相互作用，黃素酶其活性位點(diǎn)內(nèi)很容易參與到與 O2相關(guān)的電子傳遞。O2 和 H2O2 都也有研究表明呼吸鏈主要產(chǎn)生的是 O2 而不是 H在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)下產(chǎn)生可觀量的 H2O2的具體機(jī)制尚不清楚反應(yīng)(H2O2+ Fe2+→ OH +OH-+ Fe3+)產(chǎn)生的，此反應(yīng)與-韋斯反應(yīng)中三價(jià)鐵（Fe3+）被 O2 還原為 Fe2+。O2 不，還有可能還原性地攻擊攜帶鐵-硫簇的酶，從而使其and Beinert 2003)。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于麗娜;王建軍;谷瑞平;李成龍;楊鐵鋼;王岳偉;王天坤;;奶牛乳腺炎的綜合防治技術(shù)[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2018年06期

2 嚴(yán)瑩芳;;奶牛乳腺炎的病因及綜合防控措施[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2017年12期

3 張松武;張學(xué)芳;;淺談奶牛乳腺炎的綜合防治措施[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2018年01期

4 王洪海;;現(xiàn)代化牧場奶牛乳腺炎的病因及防治[J];現(xiàn)代畜牧科技;2018年05期

5 裴俊濤;;奶牛乳腺炎的病因及其防治[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2018年04期

6 李斌;;奶牛乳腺炎預(yù)防治療措施[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2018年04期

7 李忠;;奶牛乳腺炎治療研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2016年11期

8 侯寶柱;;奶牛乳腺炎治療方法比較[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2017年02期

9 賴金倫;劉玉輝;陳穎鈺;胡長敏;郭愛珍;;中藥防治奶牛乳腺炎的臨床應(yīng)用及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2017年02期

10 高集禎;;淺析奶牛乳腺炎治療[J];甘肅農(nóng)業(yè);2017年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 于辰龍;錫林高娃;吳金花;白文麗;布日額;;奶牛乳腺炎無乳鏈球菌菌體蛋白抗原研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會第五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2016年

2 溫劉發(fā);魏能;楊金波;;廣東地區(qū)奶牛乳腺炎病原菌耐藥株的分離鑒定[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應(yīng)用技術(shù)研討會論文集[C];2009年

3 王春t

本文編號：2741339