【摘要】：水貂病毒性腸炎(Mink viral enteritis,MVE)是由水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起水貂一種高度接觸性、急性傳染病,具有高發(fā)病率和高死亡率特點(diǎn),其中幼貂極易感染。MEV DNA基因組包含兩個主要的開放閱讀框:編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2以及結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,其中NS1非結(jié)構(gòu)蛋白主要調(diào)節(jié)MEV復(fù)制,反式激活編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。目前已經(jīng)被證實(shí)多種細(xì)小病毒NS1具有細(xì)胞毒性且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,因此細(xì)小病毒NS1一直是研究的熱點(diǎn)。目前MEV及其NS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理仍不明確。本研究旨在通過分析MEV及其NS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號途徑及其作用機(jī)制,為揭示MEV引起水貂致病機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。為了揭示MEV在體內(nèi)、體外是否能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。體內(nèi)方面,我們將MEVB細(xì)胞毒株感染健康的水貂,分析體內(nèi)消化道各個組織細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),感染病毒的水貂消化道組織出現(xiàn)不同程度的病理變化;采用TUNEL方法檢測凋亡細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)被病毒感染水貂的食管、小腸、腸系膜淋巴結(jié)、腎臟中發(fā)現(xiàn)有凋亡細(xì)胞,而舌沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡情況。體外方面研究發(fā)現(xiàn)MEVB感染F81細(xì)胞后,能顯著抑制細(xì)胞的生長,并且導(dǎo)致細(xì)胞在G1期的積累,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這些結(jié)果表明MEV在體內(nèi)、體外均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為了進(jìn)一步確定MEV NS1、NS2、VP1和VP2是否能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,我們分別構(gòu)建MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染到F81和HEK293T細(xì)胞中分析誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況。研究顯示NS1能顯著抑制F81和HEK293T細(xì)胞活性,對細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng),然而VP1和VP2不能抑制細(xì)胞活性且不能產(chǎn)生細(xì)胞毒性。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測NS1、NS2、VP1和VP2對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況的影響,結(jié)果顯示NS1能導(dǎo)致F81和HEK293T細(xì)胞周期阻滯在G1期,同時采用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測發(fā)現(xiàn),NS1能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MEV NS1能導(dǎo)致細(xì)胞核呈現(xiàn)碎塊狀致密濃染、并且能產(chǎn)生DNA Ladder現(xiàn)象,電鏡發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞核凝聚形成大小不等,產(chǎn)生凋亡小體。這些結(jié)果表明MEV NS1具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,而NS2、VP1和VP2不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在上述研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析MEV NS1引起細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。利用Western blot、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析MEV NS1對細(xì)胞內(nèi)Caspase和凋亡相關(guān)蛋白的影響。發(fā)現(xiàn)NS1能激活Caspase-9和Caspase-3,而Caspase-8和Caspase-12沒有被活化;同時發(fā)現(xiàn)NS1能使Bax/Bcl-2比值升高,Bcl-2(Ser 70)磷酸化;促進(jìn)Bax從胞漿中轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體,Cyt C線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)凋亡發(fā)生;NS1能降低線粒體膜電位、提高線粒體膜通透性并且導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS積累;NS1能抑制p38 MAPK和p53啟動子活性,還能導(dǎo)致p38 MAPK(Thr 180/Tyr 182)和p53(Ser 15)、p53(Ser 20)發(fā)生磷酸化;為了進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制,我們用p38 MAPK和p53特異性抑制劑預(yù)處理細(xì)胞,結(jié)果顯示NS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力顯著下降。綜合以上研究結(jié)果表明,MEV NS1通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)凋亡,同時p38 MAPK和p53在NS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 1-1 細(xì)小病毒 DNA 基因組結(jié)構(gòu) (Carter and Saunders, 2007; Kerr et al., 2006; King et al., 201igure 1-1 Parvovirus genome structure (Carter and Saunders, 2007; Kerr et al., 2006; King et al., 20圖 1-2 CPV VP2 蛋白二級結(jié)構(gòu)示意圖 (Xie; Chapman, 1996)-2 Location of secondary structural elements within the primary sequence of CPV VP2 (Xie; Chapm病毒在基因組結(jié)構(gòu)上有一個顯著的特征是在 DNA 兩端含有回文結(jié)構(gòu)形成的 B）。3 端的回文結(jié)構(gòu)長約 200 nt，形成的 Y 型結(jié)構(gòu)，5 端回文結(jié)構(gòu)長約

CPVVP2蛋白二級結(jié)構(gòu)示意圖(Xie;Chapman,1996)

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本文編號：2740331