【摘要】：本試驗以仔豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)為研究對象,闡述海藻多糖對IPEC-J2細胞屏障功能的調(diào)節(jié)作用及可能機制,研究結(jié)果可為海藻提取物在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和參考。試驗一海藻多糖對仔豬小腸上皮細胞毒性、凋亡和增殖的影響本試驗以仔豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)為模型,旨在研究海藻多糖對IPEC-J2細胞毒性、凋亡和增殖的影響。試驗選取不同濃度的海藻多糖,測定其對IPEC-J2細胞活力和LDH釋放率的影響,篩選出海藻多糖的適宜添加劑量和作用時間,在此基礎(chǔ)上,通過流式細胞術(shù)測定海藻多糖對IPEC-J2細胞凋亡和增殖的影響。試驗結(jié)果表明:(1)當海藻多糖處理IPEC-J2細胞12 h時,添加濃度范圍為8-480μg/mL的海藻多糖可以顯著促進IPEC-J2細胞的活力(P0.05)。當海藻多糖處理24 h濃度為60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL時,顯著促進IPEC-J2細胞的活力,且在240μg/mL處達到最大值,當濃度大于240μg/mL時,細胞的活力開始出現(xiàn)下降趨勢。同時在30-7680μg/mL這一范圍顯著降低LDH的釋放率(P0.05)。因此本試驗選取60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL這一濃度范圍用于后續(xù)的試驗處理。(2)與對照組相比,添加海藻多糖60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL組均顯著地降低細胞的凋亡數(shù)量(P0.05),120μg/mL和240μg/mL海藻多糖組顯著促進細胞的增殖分裂(P0.05)。綜上所述,海藻多糖可降低IPEC-J2細胞毒性和凋亡,促進IPEC-J2細胞增殖。試驗二海藻多糖對仔豬小腸上皮細胞屏障功能的調(diào)節(jié)作用本試驗通過測定緊密連接蛋白、炎癥因子和NF-κB信號通路相關(guān)基因的表達,探討添加60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖對IPEC-J2細胞機械屏障和免疫屏障功能的調(diào)控作用。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)與對照組相比,60μg/mL和120μg/mL的海藻多糖組可顯著的上調(diào)IPEC-J2細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的mRNA表達(P0.05),120μg/mL和240μg/mL海藻多糖顯著上調(diào)緊密連接蛋白Claudin-1的mRNA表達(P0.05)。同時,添加海藻多糖對Occludin蛋白的表達無顯著影響(P0.05),,添加120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖可以顯著上調(diào)IPEC-J2細胞緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的表達(P0.05)。(2)與對照組相比,添加240μg/mL海藻多糖顯著下調(diào)了TLR-4和IκBα的mRNA表達(P0.05),60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖顯著的下調(diào)了MyD88和p65的mRNA表達(P0.05),但對p65、p-p65和p-p65/p65的蛋白表達沒有顯著差異(P0.05),對細胞上清中炎癥因子IL-6和TNF-α的表達沒有顯著影響(P0.05)。綜上可知,添加海藻多糖24 h可以促進IPEC-J2細胞緊密連接蛋白的表達,下調(diào)NF-κB信號通路相關(guān)基因表達,但對細胞因子的分泌沒有顯著影響。試驗三海藻多糖對大腸桿菌感染仔豬小腸上皮細胞后損傷的修復(fù)效應(yīng)研究本試驗旨在通過海藻多糖處理IPEC-J2細胞24 h后,對大腸桿菌感染IPEC-J2細胞后的通透性,粘附入侵數(shù)活菌數(shù),緊密連接蛋白的表達量以及NF-κB通路相關(guān)基因表達的影響,闡述海藻多糖對大腸桿菌感染IPEC-J2細胞的后損傷的修復(fù)效應(yīng)研究。試驗結(jié)果表明:(1)當大腸桿菌感染90 min時,240μg/mL的海藻多糖可以顯著的緩解由大腸桿菌感染引起的IPEC-J2細胞的通透性下降,大腸桿菌感染120 min時,添加60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL海藻多糖組均可以顯著緩解由大腸桿菌感染引起的IPEC-J2細胞通透性下降,且具有劑量效應(yīng)趨勢(P0.05)。(2)大腸桿菌感染顯著降低IPEC-J2細胞緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA表達,但添加海藻多糖預(yù)處理后,顯著抑制大腸桿菌感染引起IPEC-J2細胞緊密連接蛋白相關(guān)基因表達下降(P0.05)。大腸桿菌感染2 h后可降低緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的蛋白表達,但是差異并不顯著。大腸桿菌感染4 h后,顯著的降低緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的蛋白表達,但對緊密連接蛋白ZO-1的表達無顯著影響,與大腸桿菌感染組相比,60μg/mL、120μg/m L和240μg/mL海藻多糖顯著的緩解了由大腸桿菌感染引起的IPEC-J2細胞緊密連接蛋白Occludin的蛋白表達下降(P0.05),240μg/mL的海藻多糖顯著緩解了大腸桿菌感染引起的IPEC-J2細胞緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的表達量的下降(P0.05)。(3)當大腸桿菌感染2 h時,相對于大腸桿菌感染組,60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖組可顯著的促進IPEC-J2細胞上清中炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(P0.05),當大腸桿菌感染4 h時,相對于大腸桿菌感染組,60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖可以顯著的抑制IPEC-J2細胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(P0.05)。(4)海藻多糖對大腸桿菌的活力具有抑制作用,120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖能夠降低大腸桿菌的活菌數(shù),減少大腸桿菌對IPEC-J2細胞的粘附和入侵活菌數(shù)(P0.05)。綜上所述,添加海藻多糖可以顯著緩解大腸桿菌感染對IPEC-J2細胞緊密連接蛋白的破壞,當大腸桿菌感染2 h時,海藻多糖對IPEC-J2細胞呈促炎作用,當大腸桿菌感染4 h時,海藻多糖IPEC-J2細胞呈抑炎作用,同時海藻多糖可以降低大腸桿菌的活力,減少大腸桿菌對IPEC-J2細胞的粘附和入侵的活菌數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S828.5
【圖文】：

圖 1.1 緊密鏈接復(fù)合物Fig. 1.1 tight junction complex注：引自 Susana Lechuga（2017）[30]2.1.1 Occludin 蛋白Occludin 又稱為咬合蛋白，是最早被發(fā)現(xiàn)和研究最多的緊密連接蛋白，其分子量大小約為 59 kDa，Occludin 蛋白由四個跨膜結(jié)構(gòu)域組成，分別是細胞外環(huán)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。兩個細胞外環(huán)都富含酪氨酸殘基，超過一半的殘基是酪氨酸和甘氨酸[31]。氨基酸磷酸化是影響緊密連接蛋白 Occludin 發(fā)揮屏障功能的關(guān)鍵，尤其是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化。Occludin 胞內(nèi)羧基末端的最后 150 個氨基酸可以直接與肌動蛋白相互作用，共同介導(dǎo)腸道的屏障功能，這是其他緊密連接蛋白所不具有的特性。Occludin 也能夠通過這個羧基段直接與蛋白 ZO-1、ZO-2 和 ZO-3 相互連接[32]。多胺類化合物對 Occludin 合成起著至關(guān)重要的作用，多胺的缺乏顯著的影響到緊密連接

海藻多糖對仔豬小腸上皮細胞屏障功能的調(diào)控作用炎癥是一種普遍存在的應(yīng)激反應(yīng)，抗原受體、先天免疫系統(tǒng)的受體和某些細胞應(yīng)激都可以引起 NF-κB 信號通路的激活。NF-κB/Rel 復(fù)合體包括 5 個亞單位，NF-κB2p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。NF-κB 家族轉(zhuǎn)錄因子包括促炎和抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)鍵調(diào)控因子，在宿主免疫反應(yīng)的發(fā)應(yīng)和協(xié)調(diào)中扮演著重要的共穩(wěn)態(tài)角色。過度激活則會產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)，從而引起機體的惡性腫瘤[55]。

【參考文獻】

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本文編號：2737291