發(fā)布時間：2020-07-01 15:15

【摘要】：禽白血病病毒(ALV)自從1989年報道以來,給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害。該病可使感染雞群產(chǎn)蛋量下降、繼發(fā)或/和混合感染多種疾病,引起雞群的死淘率上升,免疫抑制增強(qiáng),以及多種類型的腫瘤,損失重大。該病到目前為止還沒有有效的疫苗和治療方法。p27蛋白(ALV-p27)是病毒編碼的群特異性衣殼蛋白,在病毒中含量高,有許多易于檢測的抗原位點(diǎn),常被用于ELISA和免疫熒光的檢測。有研究表明p27可以影響一些細(xì)胞因子的表達(dá),提示ALV-p27可能在病毒感染引起的免疫抑制中發(fā)揮一定的作用。為了明確p27對免疫的影響,本研究在構(gòu)建pcDNA3.1-p27全長真核表達(dá)載體,以及p27分段表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,探究p27蛋白的免疫抑制機(jī)理。1.ALV-p27抑制DF-1細(xì)胞對LPS和Poly(I:C)的刺激為了研究在LPS和Poly(I:C)刺激后,過表達(dá)的ALV-p27在DF-1細(xì)胞中產(chǎn)生的免疫抑制作用,本研究利用實驗室已構(gòu)建的pcDNA3.1-p27真核表達(dá)載體為模板,并成功克隆構(gòu)建了 p27的兩個分段表達(dá)載體pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和pcDNA3.1-p27B(241-720bp)。將全長的p27質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞中,隨后用LPS和Poly(I:C)刺激物刺激,分別在1,6,12和24h收集細(xì)胞,提取RNA,利用Real-timePCR檢測IL-1β、IL-6、IFN-β等細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果表明,DF-1細(xì)胞中過表達(dá)的p27蛋白顯著影響免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),分段表達(dá)載體pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和 pcDNA3.1-p27B 轉(zhuǎn)染的 DF-1 細(xì)胞中,pcDNA3.1-p27B 具有抑制細(xì)胞因子表達(dá)的作用,提示p27蛋白發(fā)揮免疫抑制作用的位點(diǎn)位于480-720bp,即蛋白C端。這一結(jié)果說明ALV-p27蛋白可能通過抑制細(xì)胞因子的表達(dá)抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。2.ALV-p27抑制DF-1細(xì)胞免疫反應(yīng)機(jī)理的初步研究為了進(jìn)一步探討ALV-p27在DF-1細(xì)胞中產(chǎn)生免疫抑制作用的相關(guān)機(jī)理,利用Real-time PCR的方法檢測了 LPS和Poly(I:C)刺激細(xì)胞后,相關(guān)信號通路途徑的一些關(guān)鍵分子的基因表達(dá),結(jié)果表明,LPS刺激后,其信號通路中的IRAK4和IRF-7基因表達(dá)受到明顯抑制;而Poly(I:C)刺激后,基因水平上該信號通路的常見分子未發(fā)生顯著變化。利用雙熒光酶報告系統(tǒng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Poly(I:C)刺激后,p27蛋白可通過抑制IFN-β基因表達(dá)的啟動子抑制基因表達(dá);LPS刺激后可抑制IRF-7的啟動子活性產(chǎn)生免疫抑制作用;而MAPK相關(guān)信號通路分子蛋白磷酸化實驗結(jié)果表明,LPS和Poly(I:C)刺激后,p27蛋白明顯抑制p38蛋白的磷酸化水平從而抑制下游基因的表達(dá)。以上實驗結(jié)果表明,ALV-p27可能通過抑制信號通路相關(guān)基因分子表達(dá)、抑制細(xì)胞因子表達(dá)的啟動以及影響信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化發(fā)揮免疫抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

（ＩＲＡＫ）與死亡結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而連接Ｔｏｌｌ樣受體與下游的蛋白激酶，進(jìn)行信號逡逑ＭｙＤ８８和ＴＲＡＦ６還可以結(jié)合ＩＲＦ－７，并募集ＩＲＡＫＩ磷酸化的ＩＲＦ－７，導(dǎo)致核易位。逡逑８是通過募集一些關(guān)鍵的蛋白復(fù)合物或家族（如ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４等）來完逡逑轉(zhuǎn)導(dǎo)的，這些蛋白家族的５’端有一個可以與ＭｙＤ８８死亡結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的死亡結(jié)構(gòu)逡逑’端是絲氨酸／蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域［３５１。首先，ＭｙＤ８８與ＩＲＡＫ４形成復(fù)合物，其次，被逡逑的ＩＲＡＫＩ和ＩＲＡＫ２形成復(fù)合體，并與ＴＲＡＦ６相互作用，接著ＴＲＡＦ６結(jié)合Ｅ２泛逡逑酶，泛素化修飾ＩＲＡＫＩ和ＴＲＡＦ６，導(dǎo)致ＴＡＫ１的激活＠１。進(jìn)而激活ＭＡＰ和ＮＦ－ｋＢ逡逑從而導(dǎo)致趨化因子、Ｉ型干擾素、細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯�！醴牵停模福敢蕾囃緩�，逡逑的轉(zhuǎn)導(dǎo)是因為巨噬細(xì)胞被ＴＬＲ３和ＴＬＲ４的ＰＡＭＰＳ刺激產(chǎn)生的。非依賴途徑的機(jī)制逡逑依賴途徑，通過募集ＲＩＰ１和ＴＲＡＦ６到ＴＲＩＦ的特定區(qū)域，使其相互作用后激活ＴＢＫ１。逡逑Ｅ３連接酶－ＮＲＤＰ１的調(diào)節(jié)這兩個途徑，避免病毒入侵后炎癥因子過多而導(dǎo)致機(jī)體損逡逑邋ＴＲＡＦ３同樣在這兩個途徑中起關(guān)鍵作用，ＴＲＡＦ３的泛素化是非依賴途徑產(chǎn)生［型逡逑的必要組成部分，同時，它的泛素化降解可以促進(jìn)依賴途徑中細(xì)胞因子的表達(dá)［３８１。逡逑

－－１８Ｓ逡逑Ｒ邋５，－ＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴ－３，逡逑１．５禽白血病衣殼蛋白ｐ２７真核表達(dá)載體的構(gòu)建逡逑將實驗室己經(jīng)構(gòu)建好的ｐｃＤＮＡ３．１－ｐ２７質(zhì)粒用ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｘｈｏ邋Ｉ進(jìn)行雙酶切，鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行測序。設(shè)計帶有ｆｌａｇ標(biāo)分段表達(dá)的引物ｌ－４８０（ｐ２７Ａ段），２４１？７２０（ｐ２７Ｂ段）見圖１，ＰＣＲ擴(kuò)增引物序列如線分別為ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｘｈｏ邋Ｉ酶切位點(diǎn)：逡逑ｐ２７Ａ：邋Ｆ：邋ＧＣＧＧＡＴＣＣａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｇａｔｔａａｇ逡逑Ｒ：邋ＧＣＣＩＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣｔｃｃｃｔｇｃｇｔａａｔｇｔｃｃｇｃ逡逑ｐ２７Ｂ：邋Ｆ：ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧｇｔｔａｔａｇｃｇｇｃａｇｃｃａｃｔ，逡逑Ｒ：ＧＣＣＩＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔａｔｇｃｃｔｔｇ逡逑ＰＣＲ邋程序：９５邋°Ｃ預(yù)變性邋５ｍｉｎ，然后邋９４°Ｃ邋ｌｍｉｎ，５２°Ｃ３０ｓ，７２°Ｃｌｍｉｎ，３５邋７２０Ｃ７ｍｉｎ，４°Ｃ循環(huán)。逡逑

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本文編號：2736929