發(fā)布時(shí)間：2017-03-29 05:02

  本文關(guān)鍵詞：H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒的構(gòu)建及馬Tetherin多樣性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：馬流感(Equine influenza,EI)是由馬流感病毒(Equine Influenza Virus,EIV)引起的,以感染馬、驢等馬屬動(dòng)物為主的急性、高度接觸性呼吸道傳染病。近年來(lái),馬術(shù)賽事等相關(guān)行業(yè)蓬勃發(fā)展以及養(yǎng)馬業(yè)逐漸興起,EI的公共安全問(wèn)題在國(guó)際和國(guó)內(nèi)都得到廣泛關(guān)注。Tetherin蛋白被認(rèn)為是對(duì)于包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒具有廣泛限制作用的機(jī)體天然免疫蛋白。EIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,已經(jīng)證實(shí)Tetherin能限制其出芽。但是Tetherin蛋白在不同物種,甚至同一物種的不同個(gè)體中,都存在著基因水平的多樣性,序列差異從0.5%到4%不等,而序列上的差異可能會(huì)直接影響Tetherin對(duì)病毒的限制作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集馬匹血樣,抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄DNA,連接到pLB載體送公司測(cè)序,然后從中保留存在突變序列,將突變序列連接到載體pCMV-10上,構(gòu)建了Tetherin突變序列的真核表達(dá)載體。從18匹馬匹中,共獲得了124個(gè)Tetherin序列,其中存在突變序列26個(gè),突變類型包括替換、缺失以及提前終止,其中,兩個(gè)提前終止突變以及21號(hào)氨基酸位點(diǎn)突變極具參考價(jià)值。這些突變序列真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建,對(duì)于實(shí)驗(yàn)室后續(xù)研究Tetherin各個(gè)位點(diǎn)的功能以及Tetherin多樣性與功能的聯(lián)系等方向提供了參考和支持。病毒樣顆粒(Vriurs-likeParticles,VLPs)是近年來(lái)研究熱點(diǎn),在新疫苗開(kāi)發(fā)、分子載體以及研究某些特定蛋白的作用和病毒感染細(xì)胞機(jī)制等基礎(chǔ)研究方面具有廣泛應(yīng)用。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建馬流感VLPs在之前的研究中未有報(bào)道,且哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以最高程度的修飾VLPs,使VLPs具有和天然病毒顆粒更相似的天然構(gòu)象,特別是在基礎(chǔ)研究方面,該表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的VLPs具有更強(qiáng)的模擬性和過(guò)程重現(xiàn)性。本實(shí)驗(yàn)選取馬流感H3N8(A/equine/Miami/1/63)的HA、NA、M1、M2這4個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白,構(gòu)建真核表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞收集細(xì)胞上清液中的VLPs。對(duì)上清液測(cè)血凝,血凝效價(jià)為23。而后用自制的馬流感兔源抗體對(duì)經(jīng)過(guò)超離純化的VLPs進(jìn)行Western-blot鑒定,得到明顯對(duì)應(yīng)的病毒HA條帶。多角度證明使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了馬流感VLPs。構(gòu)建成功的馬流感VLPs可以用于實(shí)驗(yàn)室后續(xù)的EIV研究,在基礎(chǔ)研究方向,如病毒出芽機(jī)制等研究上具有很大幫助。
【關(guān)鍵詞】：馬流感 病毒樣顆粒 Tetherin 多樣性
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 1 前言11-21
• 1.1 流感病毒概述11
• 1.2 馬流感11-14
• 1.2.1 馬流感概述11-12
• 1.2.2 結(jié)構(gòu)蛋白及其作用12-13
• 1.2.3 流行病學(xué)13-14
• 1.3 Tetherin14-16
• 1.3.1 Tetherin蛋白的概述14
• 1.3.2 Tetherin多樣性14-15
• 1.3.3 本研究的目的和意義15-16
• 1.4 病毒樣顆粒16-21
• 1.4.1 病毒樣顆粒簡(jiǎn)介16-18
• 1.4.2 病毒樣顆粒常用構(gòu)建方法18-19
• 1.4.4 本研究的目的和意義19-21
• 第一部分 馬源Tetherin多樣性研究21-40
• 1 材料和方法21-31
• 1.1 材料21-23
• 1.1.1 樣品來(lái)源21
• 1.1.2 主要試劑21
• 1.1.3 主要溶液配制21-22
• 1.1.4 主要儀器及設(shè)備22-23
• 1.1.5 分子生物學(xué)軟件23
• 1.2 方法23-31
• 1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成23
• 1.2.2 血液RNA的提取23-24
• 1.2.3 目的基因cDNA第一鏈合成24
• 1.2.4 目的基因的PCR擴(kuò)增24-25
• 1.2.5 PCR產(chǎn)物的回收與純化25-26
• 1.2.6 回收純化DNA的連接26
• 1.2.7 轉(zhuǎn)化26-27
• 1.2.8 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定27-28
• 1.2.9 回收產(chǎn)物的連接28
• 1.2.10 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定28-29
• 1.2.11 重組質(zhì)粒的酶切鑒定29
• 1.2.12 重組表達(dá)質(zhì)粒的抽提29-31
• 2 結(jié)果31-36
• 2.1 目的基因Tetherin的PCR擴(kuò)增結(jié)果31
• 2.2 含有目的片段的pLB載體菌液PCR檢測(cè)結(jié)果31-32
• 2.3 重組質(zhì)粒的菌液PCR檢測(cè)結(jié)果32-33
• 2.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定33-34
• 2.5 Tetherin序列分析結(jié)果34-36
• 3 討論36-39
• 4 結(jié)論39-40
• 第二部分 馬流感病毒樣顆粒的構(gòu)建40-57
• 1 材料和方法40-49
• 1.1 材料40-41
• 1.1.1 毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40
• 1.1.2 主要試劑40
• 1.1.3 主要溶液配制40-41
• 1.2 方法41-49
• 1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成41-42
• 1.2.2 HA、NA、M1、M2基因的擴(kuò)增42-43
• 1.2.3 目的片段及載體酶切處理43-44
• 1.2.4 載體與目的片段的連接44
• 1.2.5 轉(zhuǎn)化以及重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定44
• 1.2.6 重組質(zhì)粒的酶切鑒定44
• 1.2.7 重組質(zhì)粒的制備44
• 1.2.8 哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存44-45
• 1.2.9 H3N8 EIV真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染45
• 1.2.10 馬流感H3N8兔源抗體的制備45-47
• 1.2.11 馬流感H3N8兔源抗體的Western-blot鑒定47
• 1.2.12 使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)制備H3N8 EIV病毒樣顆粒47-48
• 1.2.13 馬流感VLPs的血凝活性測(cè)定48
• 1.2.14 VLPs的超速離心純化48
• 1.2.15 Western-blot檢測(cè)VLPs的表達(dá)48-49
• 2 結(jié)果49-54
• 2.1 HA、NA、M1、M2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果49
• 2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果49-50
• 2.3 自制兔源馬流感抗體Western-blot鑒定50-51
• 2.4 馬流感VLPs的血凝效價(jià)結(jié)果51-52
• 2.5 馬流感VLPs超速離心純化52
• 2.6 馬流感VLPs的Western-blot鑒定52-54
• 3 討論54-56
• 4 結(jié)論56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-61

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒的構(gòu)建及馬Tetherin多樣性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：273703