【摘要】：曲霉菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的一種腐生真菌,其中煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)和黃曲霉菌是引發(fā)禽曲霉菌病的常見(jiàn)致病菌,尤以煙曲霉菌的致病力最強(qiáng)。臨床上,煙曲霉菌作為一種重要的條件性致病菌,通過(guò)向空氣釋放大量分生孢子(φ≈2-3μm)的方式傳播病原,這些分生孢子被宿主吸入支氣管和肺泡后可以引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,對(duì)家禽的危害尤為嚴(yán)重,尤其是對(duì)霉菌較為敏感的雛雞。已有文獻(xiàn)報(bào)道在畜禽舍的微生物氣溶膠中含有一定濃度的氣載真菌。當(dāng)空氣中少量的煙曲霉菌分生孢子被雛雞吸入時(shí)可能不會(huì)引起感染,但這部分被吸入的分生孢子是否可以在肺內(nèi)定植?定植后是否可以引起肺組織局部的先天性免疫應(yīng)答?以及是否對(duì)禽流感(AI)抗體形成影響?而目前的研究主要報(bào)道家禽感染煙曲霉菌的防治與診斷,對(duì)雛雞定植煙曲霉菌的先天性免疫應(yīng)答以及對(duì)AIV感染的免疫影響還有待研究。基于此,為了研究煙曲霉菌肺內(nèi)定植對(duì)雛雞肺部先天性免疫以及AI抗體水平的影響,本課題建立了煙曲霉菌雛雞肺部定植模型。本課題選用了200羽9日齡SPF雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物并隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組(A)、煙曲霉菌定植組(B)、H9N2 AIV感染組(C)、煙曲霉菌定植+H9N2 AIV感染組(D)、AI疫苗免疫組(E)、AI疫苗免疫+煙曲霉菌定植組(F)。9日齡和23日齡時(shí)對(duì)E、F組的雛雞頸部皮下接種0.2 mL H9亞型AI疫苗;14日齡時(shí)B、D、F組接種煙曲霉菌瓊脂珠,A組以0.3 mL生理鹽水代替;17日齡時(shí)C、D組通過(guò)點(diǎn)眼滴鼻方式接種0.2 mL H9N2 AIV。通過(guò)六胺銀(GMS)染色、真菌培養(yǎng)和鏡檢的方法確定B組的雛雞是否成功定植煙曲霉菌;利用qRT-PCR方法檢測(cè)A、B組雛雞接種煙曲霉菌瓊脂珠后第1、3、5、7天肺、脾組織中TLRs(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4)和細(xì)胞因子(IL4、IL6、IFN-α、IFN-β、TNF-α)的mRNA的表達(dá);通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)A、B組雛雞接種煙曲霉菌瓊脂珠后第2天肺組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá),并利用qRT-PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中部分先天性免疫因子(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、IL-1β、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)進(jìn)行驗(yàn)證;利用HA和HI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C、D組和E、F組的禽流感抗體效價(jià);利用qRT-PCR方法檢測(cè)C、D組雛雞肺、脾組織中先天性免疫因子(TLR3、TLR7、IL-1β、IL4、IFN-α、IFN-γ)的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示:雛雞肺內(nèi)接種0.3 mL濃度為5×10~6 CFU/mL的煙曲霉菌瓊脂珠可以使煙曲霉菌定植在雛雞肺內(nèi),且定植時(shí)間為28天;在接種煙曲霉菌瓊脂珠后第1、3、5、7天B組雛雞相對(duì)于A組雛雞的肺、脾組織中TLR1、TLR4整體下調(diào)表達(dá),TLR3整體上調(diào)表達(dá),TLR2的表達(dá)量整體較低,促炎細(xì)胞因子IL6在肺組織中下調(diào)表達(dá),脾臟中上調(diào)表達(dá),TNF-α在第3、5天上調(diào)表達(dá),IFN-α、IFN-β在肺、脾組織中整體上調(diào)表達(dá),IL4在第1、3天上調(diào)表達(dá);轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共鑒定的基因總數(shù)是17,732個(gè),其中980個(gè)差異表達(dá)基因(p0.05,倍變1.0或以上),上調(diào)基因767個(gè),下調(diào)基因213個(gè)。KEGG生物通路的免疫系統(tǒng)差異表達(dá)基因107個(gè);C組和D組雛雞的AI抗體效價(jià)在試驗(yàn)期間趨勢(shì)基本一致,差異不顯著(p0.05),E組和F組雛雞的AI抗體效價(jià)差異也不顯著(p0.05);D組雛雞肺、脾組織內(nèi)TLR3、TLR7、IL-1β、IL4、IFN-α的mRNA表達(dá)水平普遍高于C組雛雞。本研究表明:本課題成功建立了雛雞肺部煙曲霉菌定植模型;煙曲霉菌定植后引起肺組織mRNA差異表達(dá),激活了先天性免疫因子引起肺組織局部的免疫應(yīng)答;煙曲霉菌和AIV具有協(xié)同作用,能夠激活雛雞的先天性免疫因子,但對(duì)AI抗體水平的影響不顯著。總之,本研究成功地建立了雛雞肺部煙曲霉菌定植模型,并對(duì)煙曲霉菌定植雛雞的肺組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,初步研究了雛雞煙曲霉菌定植的先天性免疫反應(yīng)以及對(duì)AI抗體水平的影響,為進(jìn)一步探討煙曲霉菌與禽宿主之間的相互作用以及對(duì)其他病原菌的影響奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31
【圖文】：

圖 1 雛雞接種煙曲霉菌瓊脂珠后肺的剖檢病變Fig. 1 Anatomical changes of lung in chickens inoculated with A.fumigatus agar beads注：圖 A、B 是 D 組第 5、7 天死亡雛雞的肺組織，C、D、E、F 分別為 B 組第 1、3、7、10 天雛雞的肺組織為 A 組雛雞的肺組織。Note: Figs A and B showed lung tissues of chickens died on the 5th and 7th day in group D. CD, E and F were lung tissues of group B chickens on day 1, 3, 7 and 10, respectively. G was the lung tissue of group Achickens. 雛雞肺組織真菌培養(yǎng)形態(tài)學(xué)無(wú)菌研磨肺組織后，在 PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)菌落初始是白色絨毛狀，2~轉(zhuǎn)為綠色，數(shù)日后變?yōu)樯罹G色，呈粉末狀（圖 2A、B）。顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)物的分子的頂囊呈燒瓶狀，小梗單層顏色為深綠色，直徑約 22 μm，分生孢子梗小于 300 μm 2C）。由此見(jiàn)在接種煙曲霉菌瓊脂珠的雛雞肺組織中可以培養(yǎng)大量的煙曲霉菌，第 28 天煙曲霉菌逐漸被肺組織清除（圖 2D）。通過(guò)肺組織切片的 GMS 染色可以染成黑色的煙曲霉菌絲（圖 2E）。通過(guò)肺組織真菌培養(yǎng)和 GMS 染色，我們確定雛

圖 2 雛雞肺組織在 PDA 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)與鑒定Fig. 2 Growth and Certification of Chicken Lung in PDA Medium注：圖 A、B、D 是 B 組肺組織在 PDA 培養(yǎng)基上不同時(shí)間點(diǎn)的狀態(tài)，圖 C 是顯微鏡下 B 組培養(yǎng)物的形態(tài)，圖 E是 B 組肺組織切片的 GMS 染色，圖 F 是 A 組肺組織切片的 GMS 染色。Note: Fig A, B and D are the states of lung tissuein group B at different time points on PDA medium. Fig C is the morphology of lung tissue in group B under microscope. FigE is the result of GMS staining of lung tissue slices in group B. Fig F is the result of GMS staining of lung tissue slices ingroup A.3.4 q RT-PCR 檢測(cè)雛雞定植煙曲霉菌后先天性免疫相關(guān)因子的表達(dá)3.4.1 q RT-PCR 檢測(cè)雛雞定植煙曲霉菌后 TLRs 的表達(dá)在雛雞接種煙曲霉菌后的第 1、3、5、7 天隨機(jī)挑選接種煙曲霉菌和健康的雛雞各 3羽處死，取出脾臟與肺組織用于 qRT-PCR 檢測(cè) TLRs 的表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2736885