【摘要】：曲霉菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的一種腐生真菌,其中煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)和黃曲霉菌是引發(fā)禽曲霉菌病的常見致病菌,尤以煙曲霉菌的致病力最強。臨床上,煙曲霉菌作為一種重要的條件性致病菌,通過向空氣釋放大量分生孢子(φ≈2-3μm)的方式傳播病原,這些分生孢子被宿主吸入支氣管和肺泡后可以引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,對家禽的危害尤為嚴(yán)重,尤其是對霉菌較為敏感的雛雞。已有文獻報道在畜禽舍的微生物氣溶膠中含有一定濃度的氣載真菌。當(dāng)空氣中少量的煙曲霉菌分生孢子被雛雞吸入時可能不會引起感染,但這部分被吸入的分生孢子是否可以在肺內(nèi)定植?定植后是否可以引起肺組織局部的先天性免疫應(yīng)答?以及是否對禽流感(AI)抗體形成影響?而目前的研究主要報道家禽感染煙曲霉菌的防治與診斷,對雛雞定植煙曲霉菌的先天性免疫應(yīng)答以及對AIV感染的免疫影響還有待研究。基于此,為了研究煙曲霉菌肺內(nèi)定植對雛雞肺部先天性免疫以及AI抗體水平的影響,本課題建立了煙曲霉菌雛雞肺部定植模型。本課題選用了200羽9日齡SPF雛雞為試驗動物并隨機分為6組:空白對照組(A)、煙曲霉菌定植組(B)、H9N2 AIV感染組(C)、煙曲霉菌定植+H9N2 AIV感染組(D)、AI疫苗免疫組(E)、AI疫苗免疫+煙曲霉菌定植組(F)。9日齡和23日齡時對E、F組的雛雞頸部皮下接種0.2 mL H9亞型AI疫苗;14日齡時B、D、F組接種煙曲霉菌瓊脂珠,A組以0.3 mL生理鹽水代替;17日齡時C、D組通過點眼滴鼻方式接種0.2 mL H9N2 AIV。通過六胺銀(GMS)染色、真菌培養(yǎng)和鏡檢的方法確定B組的雛雞是否成功定植煙曲霉菌;利用qRT-PCR方法檢測A、B組雛雞接種煙曲霉菌瓊脂珠后第1、3、5、7天肺、脾組織中TLRs(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4)和細(xì)胞因子(IL4、IL6、IFN-α、IFN-β、TNF-α)的mRNA的表達;通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測A、B組雛雞接種煙曲霉菌瓊脂珠后第2天肺組織的轉(zhuǎn)錄組表達,并利用qRT-PCR方法對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中部分先天性免疫因子(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、IL-1β、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)進行驗證;利用HA和HI實驗檢測C、D組和E、F組的禽流感抗體效價;利用qRT-PCR方法檢測C、D組雛雞肺、脾組織中先天性免疫因子(TLR3、TLR7、IL-1β、IL4、IFN-α、IFN-γ)的mRNA表達。結(jié)果顯示:雛雞肺內(nèi)接種0.3 mL濃度為5×10~6 CFU/mL的煙曲霉菌瓊脂珠可以使煙曲霉菌定植在雛雞肺內(nèi),且定植時間為28天;在接種煙曲霉菌瓊脂珠后第1、3、5、7天B組雛雞相對于A組雛雞的肺、脾組織中TLR1、TLR4整體下調(diào)表達,TLR3整體上調(diào)表達,TLR2的表達量整體較低,促炎細(xì)胞因子IL6在肺組織中下調(diào)表達,脾臟中上調(diào)表達,TNF-α在第3、5天上調(diào)表達,IFN-α、IFN-β在肺、脾組織中整體上調(diào)表達,IL4在第1、3天上調(diào)表達;轉(zhuǎn)錄組測序共鑒定的基因總數(shù)是17,732個,其中980個差異表達基因(p0.05,倍變1.0或以上),上調(diào)基因767個,下調(diào)基因213個。KEGG生物通路的免疫系統(tǒng)差異表達基因107個;C組和D組雛雞的AI抗體效價在試驗期間趨勢基本一致,差異不顯著(p0.05),E組和F組雛雞的AI抗體效價差異也不顯著(p0.05);D組雛雞肺、脾組織內(nèi)TLR3、TLR7、IL-1β、IL4、IFN-α的mRNA表達水平普遍高于C組雛雞。本研究表明:本課題成功建立了雛雞肺部煙曲霉菌定植模型;煙曲霉菌定植后引起肺組織mRNA差異表達,激活了先天性免疫因子引起肺組織局部的免疫應(yīng)答;煙曲霉菌和AIV具有協(xié)同作用,能夠激活雛雞的先天性免疫因子,但對AI抗體水平的影響不顯著�？傊�,本研究成功地建立了雛雞肺部煙曲霉菌定植模型,并對煙曲霉菌定植雛雞的肺組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,初步研究了雛雞煙曲霉菌定植的先天性免疫反應(yīng)以及對AI抗體水平的影響,為進一步探討煙曲霉菌與禽宿主之間的相互作用以及對其他病原菌的影響奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31
【圖文】：

圖 1 雛雞接種煙曲霉菌瓊脂珠后肺的剖檢病變Fig. 1 Anatomical changes of lung in chickens inoculated with A.fumigatus agar beads注：圖 A、B 是 D 組第 5、7 天死亡雛雞的肺組織，C、D、E、F 分別為 B 組第 1、3、7、10 天雛雞的肺組織為 A 組雛雞的肺組織。Note: Figs A and B showed lung tissues of chickens died on the 5th and 7th day in group D. CD, E and F were lung tissues of group B chickens on day 1, 3, 7 and 10, respectively. G was the lung tissue of group Achickens. 雛雞肺組織真菌培養(yǎng)形態(tài)學(xué)無菌研磨肺組織后，在 PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)菌落初始是白色絨毛狀，2~轉(zhuǎn)為綠色，數(shù)日后變?yōu)樯罹G色，呈粉末狀（圖 2A、B）。顯微鏡下可見培養(yǎng)物的分子的頂囊呈燒瓶狀，小梗單層顏色為深綠色，直徑約 22 μm，分生孢子梗小于 300 μm 2C）。由此見在接種煙曲霉菌瓊脂珠的雛雞肺組織中可以培養(yǎng)大量的煙曲霉菌，第 28 天煙曲霉菌逐漸被肺組織清除（圖 2D）。通過肺組織切片的 GMS 染色可以染成黑色的煙曲霉菌絲（圖 2E）。通過肺組織真菌培養(yǎng)和 GMS 染色，我們確定雛

圖 2 雛雞肺組織在 PDA 培養(yǎng)基的生長與鑒定Fig. 2 Growth and Certification of Chicken Lung in PDA Medium注：圖 A、B、D 是 B 組肺組織在 PDA 培養(yǎng)基上不同時間點的狀態(tài)，圖 C 是顯微鏡下 B 組培養(yǎng)物的形態(tài)，圖 E是 B 組肺組織切片的 GMS 染色，圖 F 是 A 組肺組織切片的 GMS 染色。Note: Fig A, B and D are the states of lung tissuein group B at different time points on PDA medium. Fig C is the morphology of lung tissue in group B under microscope. FigE is the result of GMS staining of lung tissue slices in group B. Fig F is the result of GMS staining of lung tissue slices ingroup A.3.4 q RT-PCR 檢測雛雞定植煙曲霉菌后先天性免疫相關(guān)因子的表達3.4.1 q RT-PCR 檢測雛雞定植煙曲霉菌后 TLRs 的表達在雛雞接種煙曲霉菌后的第 1、3、5、7 天隨機挑選接種煙曲霉菌和健康的雛雞各 3羽處死，取出脾臟與肺組織用于 qRT-PCR 檢測 TLRs 的表達。

【參考文獻】

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本文編號：2736885