【摘要】：脂滴(LDs)是來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特殊的、復(fù)雜的、多功能的細(xì)胞器,幾乎存在于所有類型的細(xì)胞中。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展,人們對(duì)LDs的生化結(jié)構(gòu)、蛋白組學(xué)、生理功能、代謝調(diào)節(jié)和與之相關(guān)的疾病有了越來越深入的了解。細(xì)胞中有兩種分解LDs的途徑:一是通過中性脂酶,如甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感酯酶(HSL),來水解LDs中的甘油三酯(TG)和膽固醇酯(CE)等其他脂質(zhì);另一方面可以通過自噬來吞噬LDs,然后經(jīng)自噬溶酶體內(nèi)的溶解酶來降解其中的脂質(zhì)。LDs的代謝異常和功能失調(diào)與肥胖癥、脂肪肝、動(dòng)脈粥硬化、Ⅱ型糖尿病、炎癥和癌癥等多種疾病存在著密切關(guān)系。子宮頸是連接著子宮體和陰道的重要通道。妊娠期間子宮頸的關(guān)閉保證了子宮內(nèi)胎兒的正常發(fā)育。而分娩時(shí)子宮頸口的開張為足月胎兒的產(chǎn)出提供了保障。由于子宮頸口的開張和收縮都需要持續(xù)的能量供應(yīng),而提供能量的來源除糖原顆粒外,是否還由子宮頸上皮細(xì)胞中的LDs提供目前均尚不清楚,本研究旨在證明小鼠子宮頸上皮細(xì)胞(MCECs)中的LDs在饑餓狀態(tài)下的能量代謝變化。首先,采集小鼠子宮頸腔上皮層并進(jìn)行消化和分離,在DMEM/F12培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng),利用免疫熒光的方法檢測(cè)角蛋白的陽性率以證實(shí)上皮細(xì)胞的純度,結(jié)果顯示培養(yǎng)的MCECs純度98%,符合實(shí)驗(yàn)要求。隨后,用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)替換DMEM/F12培養(yǎng)液來誘導(dǎo)饑餓,分別對(duì)MCECs進(jìn)行饑餓處理0h、6h、12h和24h。利用熒光追蹤法來檢測(cè)細(xì)胞中LDs代謝的變化以及脂肪酸(FAs)在LDs和線粒體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)。在饑餓處理前用Bodipy558/568(Red C12)標(biāo)記FAs,然后開始對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理,處理結(jié)束后分別用Bodipy493/503標(biāo)記LDs和用MitoTracker Green標(biāo)記線粒體(Mito),在共聚焦顯微鏡下觀察FAs和LDs、FAs和Mito的位置關(guān)系。結(jié)果表明隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),胞漿中的FAs含量逐漸增多,FA進(jìn)入到線粒體中。同時(shí),LDs數(shù)量增多,LDs變小(p0.05)。利用甘油三酯定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)饑餓處理后細(xì)胞中TG的含量,結(jié)果顯示TG的量隨饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著減少(p0.05)。采用蛋白免疫印記技術(shù)檢測(cè)與LDs代謝相關(guān)的酶類如ATGL和HSL、及其上游調(diào)控蛋白PKA和AMPK、和自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),ATGL在6h時(shí)有顯著上升(p0.05),但在24h時(shí)顯著下降(p0.05),HSL和AMPK的表達(dá)量從12h時(shí)及以后都出現(xiàn)顯著的下降(p0.05),PKA在饑餓6h時(shí)及以后出現(xiàn)顯著的下降(p0.05),但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)量只在24h時(shí)卻顯著升高(p0.05)。在使用H89(PKA抑制劑)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATGL和HSL表達(dá)量下降更加顯著(p0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)量從6h時(shí)及以后更加顯著升高(p0.05),而AMPK表達(dá)量變化不明顯。用發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)饑餓處理后的細(xì)胞中ATP量的變化,結(jié)果顯示ATP的含量在饑餓6h時(shí)開始下降,從12h時(shí)及以后呈現(xiàn)顯著降低(p0.05)。最后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位的變化,結(jié)果表明線粒體膜電位隨著饑餓時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著降低(p0.05),這意味著Mito受損程度越來越嚴(yán)重�？傊�,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),由于上游調(diào)控中性脂酶表達(dá)的蛋白AMPK和PKA受到了抑制,ATGL和HSL的表達(dá)也受到抑制,PKA激活A(yù)TGL和HSL促進(jìn)LDs的脂解作用減弱。但在這一過程MCECs中LDs內(nèi)中性脂質(zhì)仍在被分解,釋放到胞漿中的游離FAs增多,同時(shí)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)量在加強(qiáng),這意味著此時(shí)自噬體在LDs分解代謝中發(fā)揮主要的作用。過多的FAs進(jìn)入胞質(zhì)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,造成線粒體膜電位下降,線粒體功能受損,進(jìn)而導(dǎo)致ATP合成量減少。自噬體不僅參與脂滴的分解代謝,而且還清除FAs過量所引起的損傷細(xì)胞器。LDs分解代謝過程中產(chǎn)生的FAs并沒有主要用來提供能量ATP。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.2
【圖文】：

FAs 與 Mito 的熒光共定位關(guān)系 2 可以觀察到：正常條件下，細(xì)胞中的 FAs 大多數(shù)聚集于 LDs 中。隨著長(zhǎng)，LDs 中有 FAs 釋放出來進(jìn)入到胞漿中。在共聚焦顯微鏡下可以看到 基本上共定位在 LDs 位置上，6h 和 12h 時(shí)候在 LDs 周圍可見 FAs 熒光陽 FA 熒光陽性的區(qū)域更多。同時(shí)對(duì) MCECs 細(xì)胞中的 LDs 數(shù)量和大小進(jìn)行現(xiàn) LDs 的大小是顯著減小的（p<0.05），但是數(shù)量是顯著增多的（p<0.05圖 1. 角蛋白免疫熒光法觀察原代細(xì)胞培養(yǎng)的 MCECsFig.1 Immunofluorescence of CK18 on MCECs

圖 3 可以觀察到：饑餓條件下，LDs 中釋放出來的 FAs 一部分進(jìn)入到線粒體中化為細(xì)胞提供能量，一部分游離在細(xì)胞質(zhì)中。饑餓過程中，線粒體會(huì)向 LDs 的位置靠近，方便 LDs 釋放的 FAs 迅速進(jìn)入線同時(shí)線粒體會(huì)聚集到一起，進(jìn)行融合，增加膜面積來促進(jìn)β氧化的進(jìn)行。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，6h 時(shí)候線粒體開始靠近 LDs 并在 LDs 周圍聚集；12h 時(shí)候線粒合，產(chǎn)生的較大線粒體迅速代謝掉 LDs 釋放的 FAs；然而 24h 時(shí)候由于釋放的 產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用使線粒體受到破壞，部分 FAs 重新聚集到 LDs 中去，而產(chǎn)生的 LDs 都比較小，但是數(shù)量較多（圖 3）。Fig.2 The change of the transfer of FAs and the number and size of LDsin starved MCECs

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 芮瑞;洪穎;;人體宮頸上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定[J];中國(guó)婦幼健康研究;2016年10期

2 陳傳涓;劉樹范;;宮頸上皮細(xì)胞圖象的計(jì)算機(jī)分類[J];自動(dòng)化學(xué)報(bào);1982年03期

3 張寧;張春華;;HPVE6/E7mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變的診斷價(jià)值[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2017年05期

4 李明遠(yuǎn);馬豫煥;王新榮;;單純皰疹病毒Ⅱ型誘導(dǎo)人宮頸上皮細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞的自噬活性和表達(dá)水平的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2016年10期

5 劉朝奇,韓廣州,李昆,司靜懿,劉世德,宋國(guó)興;人巨細(xì)胞病毒協(xié)同人乳頭瘤病毒16型誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞癌變的研究[J];中華病理學(xué)雜志;1999年01期

6 鐘小燁;鄧歷萍;藍(lán)云飛;崔艷萍;;非創(chuàng)傷性治療宮頸上皮細(xì)胞不典型增生的臨床研究[J];北方藥學(xué);2015年06期

7 種樹彬;曾抗;李國(guó)鋒;任非;朱曉亮;孫樂棟;周金潔;;鬼臼毒素納米脂質(zhì)載體誘導(dǎo)永生化人宮頸上皮細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制[J];山東醫(yī)藥;2011年15期

8 滕茂芳,劉樹范;放療對(duì)子宮頸上皮細(xì)胞的影響[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2005年03期

9 張家駒;宮頸上皮細(xì)胞增生不良與癌早期浸潤(rùn)時(shí)細(xì)胞DNA含量的變化[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1979年01期

10 種樹彬;曾抗;李國(guó)鋒;任非;朱曉亮;周金潔;;鬼臼毒素納米脂質(zhì)載體的制備及體外對(duì)HPV感染的永生化人宮頸上皮細(xì)胞的作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前4條

1 米賢軍;王瑩;劉曉萍;鐘守軍;段立鋒;楊偉洪;陳志強(qiáng);;FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞hTERC基因的臨床應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

2 羅新;陳舒;陳芳;陳永連;伍軍平;王曉玉;;FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞hTERC基因的表達(dá)及其臨床意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科腫瘤會(huì)場(chǎng)（婦科腫瘤學(xué)組、婦科病理學(xué)組）論文匯編[C];2012年

3 李恬;唐良萏;卞度宏;賈英;吳瑾;廖光東;黃新;張新華;;FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞hTERC基因及C-MYC基因的臨床應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科腫瘤會(huì)場(chǎng)（婦科腫瘤學(xué)組、婦科病理學(xué)組）論文匯編[C];2012年

4 陳慶云;卞美璐;劉軍;陳志華;;二氟甲基鳥氨酸對(duì)宮頸永生化細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期調(diào)控的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)婦科腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 張康;饑餓對(duì)小鼠子宮頸上皮細(xì)胞中脂滴脂解和噬脂的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 劉麗;精漿對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系及正常宮頸上皮細(xì)胞端粒酶作用的研究[D];山東大學(xué);2009年

3 章鑒洋;宮頸上皮細(xì)胞HPV感染相關(guān)膜受體差異性表達(dá)與HPV型別特異性的相關(guān)性研究[D];浙江大學(xué);2015年

4 鄧齊;人乳頭瘤病毒16型E6E7基因?qū)υ訉m頸上皮細(xì)胞的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

5 陳瑋;諾帝對(duì)HPV16亞基因永生化人宮頸上皮細(xì)胞的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

6 李雅;正常宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的改良及HPV E6基因感染的研究[D];鄭州大學(xué);2017年

7 李耀林;Daxx-C抗體的制備及其在HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞中的初步應(yīng)用[D];南華大學(xué);2013年

8 向陽;FISH技術(shù)在宮頸癌和乳腺癌檢測(cè)中的臨床應(yīng)用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2736805