【摘要】：外胞體(Exosome)中的miRNA具有調(diào)控動物生長的功能,miRNA(microRNA)是一類長度約為22nt的非編碼的小分子RNA,其可通過靶向降解mRNA或抑制蛋白的翻譯在動物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。本試驗為進(jìn)一步探討Exosome中miRNA對延邊黃牛生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制,從延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中分離miRNA,通過RNASEQ測序和生物信息學(xué)技術(shù)分析延邊黃牛及韓延牛血液Exosome中miRNA的表達(dá)特點。試驗結(jié)果如下:1、對延邊黃牛和韓延牛的血液Exosome中的總RNA進(jìn)行提取并進(jìn)行純度和質(zhì)量檢測。結(jié)果顯示,獲得的總RNA主要為RNA為5S,表明獲得的總RNA樣品完整性較好。在260nm和280nm下的OD值為1.8-2.2,說明所提取的RNA質(zhì)量較好,無其他雜質(zhì),符合試驗要求可用于后續(xù)分析。2、分別對延邊黃牛與韓延牛的血液Exosome中的小RNA進(jìn)行測序,結(jié)果表明,延邊黃牛血液Exosome的小RNA文庫共獲得18551862條原始序列;韓延牛血液Exosome的小RNA文庫共獲得17203718條原始序列,堿基錯誤率較低,測序質(zhì)量較高。原始序列數(shù)據(jù)過濾結(jié)果表明,在延邊黃牛血液Exosome中的clean reads所占的比例為93.09%;韓延牛血液Exosome中clean reads所占比例為82.74%。檢測質(zhì)量80%,符合測序要求。3、對延邊黃牛與韓延牛的血液Exosome中小RNA樣品的純凈序列進(jìn)行了核苷酸長度統(tǒng)計分析。結(jié)果表明,延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中小RNA序列長度主要分布在17-30 nt。4、miRNA的鑒定結(jié)果表明,延邊黃牛血液Exosome中已知miRNA為912條,新發(fā)現(xiàn)的miRNA為115條;韓延牛血液Exosome中已知miRNA為905條,新發(fā)現(xiàn)的miRNA為317條。新miRNA預(yù)測結(jié)果表明,在兩個品種中一共檢測到187個新miRNA,其中延邊黃牛中有41個新miRNA,韓延牛中有146個新miRNA。5、miRNA差異表達(dá)分析結(jié)果表明,在延邊黃牛和韓延牛中獲得差異表達(dá)miRNA有524個,其中上調(diào)表達(dá)的271個,下調(diào)表達(dá)的253個。已知miRNA382個,新 miRNA 142 個。6、差異表達(dá)miRNA的靶基因結(jié)果表明,在兩個品種牛中共預(yù)測到52348個靶基因。GO富集分析可知,這些靶基因被富集到3473條生物學(xué)過程,394條細(xì)胞組分以及879條分子功能。KEGG分析可知,這些預(yù)測得到的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號通路中,最顯著富集的通路為mTOR信號傳導(dǎo)通路。綜上所述,我們獲得了在韓延牛和延邊黃牛血液Exosome中差異表達(dá)的miRNA種類,并對差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測分析及GO和KEGG分析,為下一步將選取關(guān)鍵差異表達(dá)miRNA研究相關(guān)miRNA如何通過關(guān)鍵信號通路調(diào)控延邊黃牛和韓延牛生長發(fā)育調(diào)控的,從而在分子水平上探討影響邊黃牛和韓延牛生長發(fā)育差異的機(jī)制提供了試驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823
【圖文】：

）小邋ＲＮＡ邋的邋ｃＤＮＡ邋文庫建立：利用邋Ｆｉｒｓｔ邋Ｓｔｒａｎｄ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋ａｎｄ邋Ｓｕｐｅｒ邋Ｓｃｒｉｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）對（３）步驟獲得的連接產(chǎn)物先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)５°Ｃ，ｌＯｍｉｎ邋；邋４８°Ｃ，３ｍｉｎ；邋４２°Ｃ，ｌｈ；邋７０°Ｃ，邋１５ｍｉｎ。然后對獲得物利用ＰＣＲ尾巴引物和ＰＣＲＭｉｘ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：９８°Ｃ下進(jìn)行一個循環(huán)，接著在９８°Ｃ，１５邋ｓ，７２°Ｃ，邋１５邋ｓ條件下進(jìn)行１５個循環(huán)２°Ｃ，ｌＯｍｉｎ條件進(jìn)行一個循環(huán)，最后４°Ｃ保存，獲得ｃＤＮＡ文庫。逡逑）邐ＰＣＲ產(chǎn)物的純化：使用１５°／0ＴＢＥ的ＰＡＧＥ膠對ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收產(chǎn)物溶于ＥＢ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ。最后貼上標(biāo)簽，至此文庫構(gòu)建完成，用于定。逡逑）文庫質(zhì)量檢測：將構(gòu)建好的文庫使用Ａｇｉｌｅｎｔ邋２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ和ＡＢＰｌｕｓ邋Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ邋Ｓｙｓｔｅｍ進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢測。逡逑ｉＲＮＡ測序文庫的構(gòu)建具體流程如圖１所示。逡逑

ＲＮＡ主要為５Ｓ和少量的１８Ｓ，而經(jīng)ＤＮａｓｅ消化后，電泳顯示條帶與未處理時相逡逑同。但經(jīng)ＲＮａｓｅ處理后，樣品內(nèi)的ＲＮＡ完全被消化，電泳圖內(nèi)未顯示有任何條逡逑帶（圖３）。樣品ＲＮＡ完整性檢測結(jié)果表明，其主要ＲＮＡ為５Ｓ邋（圖４），說明逡逑提取的ＲＮＡ降解程度較低，完整性較好，無其雜質(zhì)污染，可用于后續(xù)研宄。逡逑對提取的總ＲＮＡ使用核酸蛋白測定儀測定，結(jié)果顯示，在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ逡逑下的ＯＤ值為１．８－２．２，此結(jié)果說明所提取的ＲＮＡ質(zhì)量較好，無其他雜質(zhì)，符合逡逑試驗要求能夠用于進(jìn)一步的測序分析。逡逑１邋２邋３逡逑■邐ＰＵ］邋ｊ邐５Ｓ逡逑：丨：Ｌ＿ｊ逡逑〔｜＿邋Ｖ邐．．．邋■邋Ｉ邋．ＭＵ邋Ｉ邋—邋－邋１邋１１１邋１邋＜！■逡逑Ｌ＿１邋Ｉ￣￣Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑一邋ＲＮａｓｅ邐２５邋２００邋１０００邋４0ｏｏ邐［ｍｊ逡逑七邋ＤＮａｓｅ逡逑Ｍ：ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－３：血液邋Ｅｘｏｓｏｍｅ邋總邋ＲＮＡ逡逑圖３總ＲＮＡ電泳檢測邐圖４總ＲＮＡ完整性檢測逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邐Ｆｉｇ．邋４邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ邋Ｔｅｓｔｉｎｇ逡逑２邋ｍｉＲＮＡ測序結(jié)果逡逑２．１測序數(shù)據(jù)質(zhì)量逡逑本試驗通過深圳華大基因公司Ｈｉｇｈ－ｓｅｑ測序平臺分別對延邊黃牛（ＹＢＹＣ）逡逑與韓延牛（ＨＹＣ）的血液Ｅｘｏｓｏｍｅ中小ＲＮＡ進(jìn)行了測序，測序產(chǎn)生數(shù)據(jù)如表１逡逑１７逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2735751