發(fā)布時間：2020-06-30 17:35

【摘要】：無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)又稱B 組鏈球菌(GroupB Streptococcus,GBS)可感染包括人、奶牛、魚等在內(nèi)的多種宿主。GBS感染人可引起孕婦早產(chǎn)、新生兒敗血癥和腦膜炎、成年人軟組織感染和腦膜炎,感染奶牛造成奶牛乳腺炎嚴(yán)重影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量,感染魚類引起腦膜腦炎造成大面積養(yǎng)殖魚類死亡。牛奶和魚類是人類重要的食物蛋白來源,規(guī)模化養(yǎng)殖的奶牛和魚類與人類接觸密切,而人對GBS的高攜帶率,造成GBS在人、牛和魚間的跨宿主感染風(fēng)險極高。但目前臨床人�；蛉唆~間是否存在交叉感染或牛和魚是否可作為感染人GBS的儲存池及人源GBS是否在牛和魚進(jìn)行傳播還未有定論。因此,有必要對GBS跨宿主感染風(fēng)險進(jìn)行評估并研究其跨宿主感染機(jī)制。基因水平轉(zhuǎn)移促進(jìn)了細(xì)菌基因組的快速演變,并可能參與菌種的形成。GBS種內(nèi)或種間基因組重組頻繁發(fā)生并且可發(fā)生基因組大片段的交換,造成GBS基因組呈馬賽克結(jié)構(gòu),是GBS遺傳分化的主要驅(qū)動力�？梢苿舆z傳元件(MGEs)包括結(jié)合性質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子和整合接合元件(ICEs)等。通過基因水平轉(zhuǎn)移可造成GBS種內(nèi)基因組分化和毒力克隆的出現(xiàn),影響GBS的生態(tài)位和宿主適應(yīng)性。對毒力差異和宿主特異性的GBS菌株進(jìn)行比較基因組學(xué)研究,可快速獲得非必需基因、基因缺失或突變、差異表達(dá)蛋白等相關(guān)信息,是研究GBS跨宿主感染、致病性和免疫原性的有效途徑。因此,本研究首先對在廣西地區(qū)收集的92株人源致病性GBS進(jìn)行了莢膜血清型、MLST、PFGE、抗生素抗性和毒力相關(guān)基因分析,通過動物感染試驗(yàn)及病理組織切片研究人源GBS對羅非魚的致病性,進(jìn)而有針對性的對跨宿主感染能力不同的人源GBS菌株開展基因組測序、泛基因組、全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因組序列變異分析、CRISPRs結(jié)構(gòu)和前噬菌體分析等比較基因組學(xué)研究,探討GBS的跨宿主感染機(jī)制。主要取得以下結(jié)果:1.92株人源GBS分別來源于19種疾病,其中來源婦女菌株最多,占總菌株數(shù)的75%。MLST分析發(fā)現(xiàn)CC103菌株比例極顯著升高(20株,21.74%),特別是ST485(13株,14.13%)可感染包括新生兒在內(nèi)造成多種疾病;發(fā)現(xiàn)3株被認(rèn)為是特異性感染奶牛的CC67菌株,并且重組獲得了ST17菌株特有超強(qiáng)毒力基因gbs2018C。牛源和人源CC103菌株交錯構(gòu)成獨(dú)立進(jìn)化分枝,3株人源CC67菌株與特異性感染奶牛的ST61和ST67菌株聚為同一進(jìn)化分枝。2.92株人源GBS跨宿主感染羅非魚,發(fā)病羅非魚表現(xiàn)出體色發(fā)黑、出血、轉(zhuǎn)圈等典型癥狀,病理組織切片分析發(fā)現(xiàn)GBS可突破血腦屏障進(jìn)入腦組織并大量增殖。同時發(fā)現(xiàn)所有ST23菌株(21株,22.83%)對羅非魚具有高致病性,而ST19菌株對羅非魚致病性與菌株血清型存在關(guān)聯(lián),17株血清型Ⅲ的CC19菌株對羅非魚的致病力全部較弱或無致病性,而11株血清型V的CC19菌株和1株血清型Ⅱ的CC19菌株對羅非魚的致病力全部較強(qiáng)。2株人源致病性ST1菌株對羅非魚致病性截然不同,NNA048對羅非魚的致病力與羅非魚源GBS無差異,而NNA038對羅非魚確無致病力。3.比較基因組學(xué)研究顯示牛源和人源的GBS CC103菌株具有很近的親緣關(guān)系,CC103菌株在人和牛交叉?zhèn)鞑ゲ⑦M(jìn)化出多個菌群進(jìn)化分枝,其中ST485菌群進(jìn)化分枝的菌株特異性感染人且具有高致病力,該菌群菌株相對其他CC103菌株基因組均發(fā)生Lac.2缺失和CadDX基因獲得。4.羅非魚高致病力和無致病力ST23 GBS菌株基因組比較和前噬菌體分析結(jié)果顯示菌株間的差異主要為前噬菌體序列。其中P1區(qū)域的前噬菌體GC含量為43%左右,編碼28～39個蛋白,介導(dǎo)GBS通過噬菌體重組獲得細(xì)菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的YafQ/DinJ結(jié)構(gòu)。具有該前噬菌體的ST23 GBS對羅非魚無致病性,而不具有該前噬菌體或該前噬菌體發(fā)生了基因變異或缺失(特別是缺失YafQ/DinJ結(jié)構(gòu))ST23GBS對羅非魚具有高致病性。羅非魚高致病力和無致病力ST1 GBS菌株NNA048和NNA038基因組比較結(jié)果顯示基因組差異主要為噬菌體序列差異,NNA048基因組特異具有一個長度為49.8 kb編碼68個蛋白的完整噬菌體序列,基因組間共有96個SNVs和 6 個 indels。5.GBS ST19血清型Ⅲ菌株的核心基因數(shù)量比例(67.09%)低于血清型V菌株(70.59%)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示Ⅲ型菌株間的進(jìn)化距離比V型菌株間的進(jìn)化距離更遠(yuǎn)。血清型Ⅲ菌株的CRISPRs結(jié)構(gòu)比血清型V菌株的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,插入序列數(shù)量和類型均多于V型菌株。基因組比較結(jié)果顯示血清型Ⅲ菌株和血清型V菌株的莢膜多糖區(qū)域(約111 kb)及與其毗鄰的ICEs區(qū)域(約106kb)發(fā)生了大片段重組。莢膜多糖區(qū)域包括整個莢膜多糖操縱子。血清型Ⅲ菌株的ICEs區(qū)域包含具有mega element的ICE且菌株間變異較大,而血清型V菌株的ICEs region包含具有IQ element和erm(TR)的ICEs且菌株間非常保守。綜上所述,本研究首先明確了人源不同血清型、CC群或ST型GBS對羅非魚的致病性及部分菌株與牛源菌株的關(guān)系,然后通過比較基因組學(xué)探討了不同類群GBS的跨宿主感染機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了 ICEs、噬菌體、莢膜多糖、YafQ/DinJ、Lac.2和CadDX等基因組結(jié)構(gòu)或相關(guān)基因在GBS跨宿主感染中的重要作用,對GBS流行疾病的防控及疫苗開發(fā)具有重要意義,為進(jìn)一步闡明GBS的跨宿主感染機(jī)制打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943;S855.99
【圖文】：

３．６．１菌毛島逡逑ＧＢＳ邋菌毛島共有邋４邋種類型（ＰＩ－２ａ、ＰＩ－２ｂ、ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ａ、ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ｂ）。通過邋ＰＣＲ邋檢逡逑測，９２株ＧＢＳ菌株中均表現(xiàn)為這４種類型菌毛島的至少其中１種類型（圖１－３）。所有逡逑菌株中不是檢出有ＰＩ－２ａ邋（檢出率６５．２％），就是檢出有ＰＩ－２ｂ邋（檢出率３４．８％）。而ＰＩ－１逡逑的檢出率是４８．９％，分別與ＰＩ－２ａ或ＰＩ－２ｂ形成組合類型。４種菌毛島類型中，ＰＩ－２ａ型逡逑為最常見型，其次分別是ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ａ、ＰＩ－２ｂ和ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ｂ。菌毛島類型與ＳＴ有很強(qiáng)的逡逑相關(guān)性，ＳＴ１７邋（１０／１０，１００％）和邋ＳＴ４８５邋（１３／１３，１００％）全部表現(xiàn)為邋ＰＩ－２ｂ邋型，ＳＴ２３逡逑（１０／１０，１００％）則全部表現(xiàn)為邋ＰＩ－２ａ邋型，ＳＴ１９邋（２３／２３，１００％）和邋ＳＴ１０邋（４／４，１００％）逡逑全部表現(xiàn)為ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ａ型。ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ｂ僅檢出２株，均屬于ＣＣ６７。菌毛島類型與血清學(xué)逡逑也有一定的相關(guān)性，血清型ｌａ大部分菌株（１６／２６，邋６１．５％）表現(xiàn)為ＰＩ－２ｂ型，而血清型逡逑ｌｂ邋（９／１３

后死亡數(shù)在３？５尾，定議為“中等”的１８株細(xì)菌感染羅非魚后死亡數(shù)在０？３尾，定逡逑義為“弱”的２２株細(xì)菌和定義為“不能感染”的１４株細(xì)菌感染羅非魚后未出現(xiàn)死亡。逡逑進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)（圖１－５），９２株人源ＧＢＳ對羅非魚致病性與其ＳＴ／ＣＣ和血清型存在很逡逑大的關(guān)聯(lián)，如１０株血清型ｌａ的ＳＴ２３菌株對羅非魚均具有高致病性（“超強(qiáng)”），１７株血逡逑清型ＩＩＩ的ＣＣ１９菌株對羅非魚的致病力全部較弱（４株“不能感染”，１１株“弱”，２株逡逑“中等”），而１１株血清型Ｖ的ＣＣ１９菌株和１株血清型ＩＩ的ＣＣ１９菌株對羅非魚的致病逡逑力均較強(qiáng)（１株“超強(qiáng)”，１１株“強(qiáng)”）。血清型ｌａ的ＣＣ１０３不同ＳＴ型菌株對羅非魚致逡逑病性存在很大差異，１株ＳＴ１０３和２株ＳＴ９３０邋（ＳＴ１０３的ＳＬＶ）致病性均很強(qiáng)（全部為逡逑“超強(qiáng)”），而１３株ＳＴ４８５致病力均較弱（５株“不能感染”，２株“弱”，６株“中等”）。逡逑所有感染死亡羅非魚均表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，如嗜睡、厭食、不規(guī)則游動、鰭基部出逡逑血、雙側(cè)或單側(cè)眼球突出變渾濁

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6 程由

本文編號：2735602