【摘要】：近年來,流感病毒感染性與致病性的改變給公共衛(wèi)生安全造成了越來越嚴(yán)重的威脅。因此,流感病毒的毒力因子及致病機(jī)制研究對(duì)于流感的防控及抗病毒藥物的研制至關(guān)重要。最近研究發(fā)現(xiàn)流感病毒片段3不僅編碼PA蛋白,還編碼一種新型蛋白"PA-X"。PA-X是一種融合蛋白,其N-末端的191個(gè)氨基酸由PA開放閱讀框編碼,而C末端氨基酸由+1核糖體移碼而產(chǎn)生的開放閱讀框編碼。之前對(duì)PA-X的功能研究?jī)H局限于1918H1N1歷史上流行的具有特殊性的病毒株。PA-X在當(dāng)前流行的流感病毒毒株,包括2009大流行H1N1人群流行毒株以及H5亞型禽流感病毒中的功能及其作用機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。 為了了解PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能及其作用機(jī)制,我們利用定點(diǎn)突變技術(shù)及反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了pHIN1和H5N1PA-X缺失病毒,通過比較分析pHINl和H5N1親本病毒及其對(duì)應(yīng)的PA-X缺失病毒在體外細(xì)胞系及小鼠模型中的復(fù)制力及致病性,來探究PA-X基因在pH1N1和H5N1病毒中的作用。為了進(jìn)一步揭示PA-X影響病毒致病性的機(jī)制,本研究評(píng)價(jià)了PA-X缺失后病毒的聚合酶活性、PA蛋白的表達(dá)水平以及PA蛋白的功能變化包括PA蛋白的核蓄積能力及PA蛋白抑制基因合成能力等。研究結(jié)果表明：(1)PA-X缺失增強(qiáng)了pH1N1和H5N1病毒在A549細(xì)胞中的復(fù)制水平及誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡水平。(2)小鼠實(shí)驗(yàn)表明PA-X缺失顯著增強(qiáng)了pH1N1和H5N1病毒的致病性,這與PA-X缺失病毒在小鼠肺臟中的高水平復(fù)制和誘導(dǎo)產(chǎn)生高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子有關(guān)。(3)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：PA-X缺失可能是通過提高pH1N1和H5N1病毒PA蛋白的表達(dá)水平,增強(qiáng)病毒的聚合酶活性,從而增強(qiáng)病毒的復(fù)制力及致病性。(4)PA-X缺失還影響PA蛋白功能。在pHlNl和H5N1病毒背景下,PA-X缺失的PA蛋白核蓄積能力明顯增強(qiáng),然而其抑制共轉(zhuǎn)染基因的能力發(fā)生了顯著性下降,表明PA-X在抑制宿主蛋白合成中起到重要的作用。 PA-X基因遺傳進(jìn)化分析表明,流感病毒根據(jù)PA-X的X-ORF長(zhǎng)度可分為兩組：表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的病毒(X-ORF是61個(gè)氨基酸,全長(zhǎng)252個(gè)氨基酸)和表達(dá)截短PA-X的病毒(X-ORF是41個(gè)氨基酸,全長(zhǎng)232個(gè)氨基酸)。全長(zhǎng)和截短的PA-X相差ORF C末端233-252位的20個(gè)氨基酸。所有的禽流感病毒包括H5N1和H9N2病毒均表達(dá)全長(zhǎng)的PA-X蛋白,而以pHlNl病毒為代表表達(dá)截短的PA-X蛋白。然而,這兩種形式的PA-X蛋白在流感病毒中的功能是否相同仍不得而知。為了確定這兩種形式的PA-X在流感病毒中的功能是否存在差異,我們以pHIN1、H5N1和H9N2病毒為現(xiàn)流行于人群和禽群中的代表毒株探究了PA-X基因C末端20個(gè)氨基端對(duì)流感病毒復(fù)制力及致病性的影響。本研究通過延長(zhǎng)pH1N1病毒的PA-X以及截短H5N1和H9N2病毒的PA-X,并評(píng)價(jià)PA-X延長(zhǎng)或截短后病毒體內(nèi)外生物學(xué)特性的變化,以揭示PA-X蛋白C末端233-252位的20個(gè)氨基酸在流感病毒中的作用。研究結(jié)果表明：(1)在這三株病毒背景下,表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的病毒與表達(dá)截短PA-X的病毒相比能夠在人肺臟細(xì)胞系中更好的復(fù)制和誘導(dǎo)更高的細(xì)胞凋亡水平。(2)小鼠實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的pHIN1、H5N1和H9N2病毒對(duì)小鼠致病性顯著強(qiáng)于其對(duì)應(yīng)的PA-X截短病毒。表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的病毒較PA-X截短病毒在小鼠肺臟中的高病毒滴度和誘導(dǎo)的高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子可能是其致病性增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。(3)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明：PA-X延長(zhǎng)或截短雖不影響PA蛋白的表達(dá)水平,但是表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的PA質(zhì)粒較PA-X截短的PA質(zhì)粒能夠更有效地抑制外源蛋白的表達(dá)。而且,體外共轉(zhuǎn)染pEGFP和只表達(dá)C末端20個(gè)氨基酸的質(zhì)粒試驗(yàn)直接驗(yàn)證了PA-X基因C末端233-252位氨基酸具有強(qiáng)烈地抑制蛋白合成的能力。這一結(jié)果暗示：表達(dá)全長(zhǎng)PA-X的病毒能夠更有效的抑制宿主蛋白的合成,有利于病毒本身的復(fù)制及傳播,這可能與其致病性增強(qiáng)密切相關(guān)。上述研究結(jié)果表明PA-X基因C末端233-252位氨基酸是A型流感病毒的重要毒力調(diào)控因子。 綜上所述,研究表明PA-X缺失可能通過上調(diào)PA蛋白的表達(dá)水平來增強(qiáng)病毒的聚合酶活性,從而有利于病毒本身的復(fù)制：PA-X缺失病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平上調(diào)及宿主炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可能是其致病性增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。PA-X蛋白C末端20個(gè)氨基酸能夠強(qiáng)烈抑制共轉(zhuǎn)染基因的表達(dá),這可能會(huì)增強(qiáng)全長(zhǎng)PA-X蛋白抑制宿主蛋白合成的能力,從而增強(qiáng)病毒體內(nèi)外的復(fù)制力及致病性。本研究解析了PA-X基因在調(diào)控目前流行流感病毒致病性及致病機(jī)制中的作用,并揭示了不同形式的PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能差異,為闡明流感病毒致病性的分子機(jī)制奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

圖 2-1 pUW2000 質(zhì)粒圖譜（Hoffmann e/fl/.. 2000)Fig. 2-1 pIIW2000 vector map (Hoffmann et al., 2000)2.2.5病毒RNA的提取

2-2 pHlN丨和H5N1病毒PA-X缺失的PA基因片段PCR純化回收g. 2-2 PCR products of PA gene in absence of PA-X of pH IN land H5N1 Trans5K DNAMarker(5000bp，3000bp，2000bp, 1500 bp, lOOObp,-FSPA。傳操作系統(tǒng)質(zhì)粒敲除PA-X的PA基閃H5N1病怳突變后的PA基閃與PHW2000載體丨丨j Bsmbl接突變的PA基閃與PHW2000載體，轉(zhuǎn)化Trans-Tl測(cè)序，確定PA基閃發(fā)生正確突變且無其他點(diǎn)突變后（圖

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2735502