【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)又稱弓漿蟲,能感染人和200多種其他脊椎動物,寄生于所有有核細胞。作為機會性致病寄生蟲,其終末宿主為貓科動物,人及其它畜禽均可成為其中間宿主,屬人獸共患寄生蟲。弓形蟲病呈世界性分布,給公共衛(wèi)生安全帶來了極大的挑戰(zhàn)。弓形蟲發(fā)育過程可見速殖子、緩殖子、配子體、包囊、裂殖體五種階段。在中間宿主體內(nèi),當(dāng)環(huán)境適宜時,以速殖子形式存在于有核細胞內(nèi),進行內(nèi)二分裂或內(nèi)芽生增殖;在終末宿主貓科動物體內(nèi),大小配子體結(jié)合形成卵囊,在小腸絨毛上皮細胞內(nèi)發(fā)育成熟。弓形蟲感染形式多種,可經(jīng)消化道黏膜、胎盤、血液、損傷的皮膚等途徑感染,通過血液循環(huán)系統(tǒng)到達全身有核細胞內(nèi)。作為一種重要的食源性寄生蟲,經(jīng)消化道感染弓形蟲是其主要的感染途徑,全世界約三分之一的人感染弓形蟲。作為機會性致病寄生蟲,機體的免疫狀況對弓形蟲感染及病程起重要作用。發(fā)達地區(qū)血清陽性率相對欠發(fā)達地區(qū)為低。隨著貓狗等伴侶動物飼養(yǎng)的日益普遍,經(jīng)貓狗糞便污染食物感染弓形蟲的比重逐漸升高;而在食品生產(chǎn)過程中,生熟不分導(dǎo)致交叉污染也增加了弓形蟲感染的風(fēng)險。本文首先對剛地弓形蟲表面抗原糖蛋白相關(guān)序列(Surface antigen glycoprotein 1-related sequences)SRS47D蛋白進行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測其免疫原性及功能。利用在線軟件ProtParam、SOSUI、SOPMA、TMHMM、MotifScan和SYFPEITHI,預(yù)測SRS47D的一、二、三級結(jié)構(gòu)、組成、抗原表位及潛在功能。結(jié)果顯示,SRS47D蛋白含有376個氨基酸,分子質(zhì)量約為40 ku。在其二級結(jié)構(gòu)中,α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲分別占23.14%、19.68%、2.39%和54.79%。SRS47D蛋白具有信號肽序列、18個親水區(qū)域(臨界值為1.9)、8個柔性區(qū)域(臨界值為2)和17個表面可及性區(qū)域(臨界值為1.9),但無跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。其翻譯后修飾位點中包含兩個糖原合成酶激酶位點和兩個O-GlcNAc糖基化位點,而不存在N-GlcNAc和C-GlcNAc糖基化位點。與弓形蟲表面抗原糖蛋白1(SAG1)蛋白三級結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn),在β折疊處存在重疊。SRS47D蛋白具有24個限制性CTL細胞表位、13個限制性Th細胞表位和10個B細胞抗原表位,提示SRS47D蛋白的免疫原性較好,是潛在的弓形蟲病疫苗候選分子。為表達弓形蟲SRS47D基因、確定SRS47D蛋白在弓形蟲中的定位,通過RT-PCR方法擴增SRS47D基因,插入原核表達載體pColdⅠ,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,通過SDS-PAGE分析重組蛋白表達情況,Western blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性;利用His柱純化重組蛋白,免疫新西蘭白兔,制備抗血清,通過間接ELISA檢測血清效價;利用免疫熒光法檢測蛋白在弓形蟲速殖子中的定位。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D,在大腸桿菌BL21(DE3)中以包涵體形式表達,表達產(chǎn)物大小約為55 ku;重組蛋白能與感染弓形蟲的小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng);免疫兔血清效價達到1:51 200;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,SRS47D蛋白分布在弓形蟲速殖子表面,尤其是前部和后部表膜。研究結(jié)果為進一步深入研究弓形蟲SRS47D的特性和功能奠定了基礎(chǔ)。為探究弓形蟲表面抗原糖蛋白相關(guān)序列SRS47D與SRS37A、SRS23蛋白之間的互作關(guān)系,以及不同結(jié)構(gòu)域間的互作模式,構(gòu)建了SRS47D、SRS37A和SRS23基因,以及SRS47D、SRS37A蛋白各2個結(jié)構(gòu)域編碼基因的雙分子熒光互補質(zhì)粒,分別共轉(zhuǎn)染Vero細胞,利用雙分子熒光互補技術(shù),觀察其是否存在互作關(guān)系;同時,利用免疫熒光共定位和激光共聚焦顯微技術(shù),進一步檢測SRS47D與SRS37A、SRS23蛋白之間的互作關(guān)系。結(jié)果成功地構(gòu)建了SRS47D、SRS37A和SRS23基因,以及SRS47D、SRS37A蛋白各2個結(jié)構(gòu)域編碼基因的雙分子熒光互補質(zhì)粒;雙分子熒光互補實驗顯示,SRS47D與SRS37A發(fā)生相互作用,而與SRS23不發(fā)生相互作用;SRS47D-D1、SRS47D-D2與SRS37A-D1、SRS37A-D2均發(fā)生相互作用;免疫熒光共定位顯示,SRS47D與SRS37A共定位在弓形蟲速殖子表面多個部位,尤其是前、后部外膜。根據(jù)這些結(jié)果,推測SRS47D的兩個結(jié)構(gòu)域與SRS37A的兩個結(jié)構(gòu)域之間存在緊密的兩兩互作關(guān)系,而SRS47D與SRS23之間不發(fā)生相互作用。首次探究了重組蛋白rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A與rSRS47D聯(lián)合免疫對小鼠弓形蟲感染的保護效果。對免疫小鼠產(chǎn)生的抗體水平、抗體的體外阻斷能力、脾淋巴細胞增值能力、細胞因子消長變化、T淋巴細胞亞型鑒定及感染小鼠存活時間等進行了測定。結(jié)果顯示,rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A和rSRS47D蛋白聯(lián)合免疫小鼠均能使小鼠產(chǎn)生顯著的IgG水平(p0.0001)。50、100、200、300、400μg/mL兔抗rSRS47D IgG均能顯著抑制弓形蟲入侵Vero細胞(p0.05),且隨著IgG濃度的提高,阻斷效果不斷提高。3個免疫組均能極顯著地刺激脾淋巴細胞的增殖(p0.0001),而對照組之間差異不顯著(p0.05)。rSRS47D、rSRS37A和rSRS47D試驗組IL-17A分泌水平在1免后2 w顯著升高(p0.05),而此時IL-6分泌水平才剛開始上升;2免后1 w,IL-17A分泌水平較1免后2 w有所下降,而IL-6分泌水平達到最高;3免后,IL-6分泌水平隨IL-17A分泌水平的變化而變化,提示IL-6的分泌滯后于IL-17A。TNF分泌水平呈現(xiàn)先升高,再有所下降,然后再次升高的過程。rSRS37A實驗組在1免后2 w IFN-γ分泌水平即顯著升高(p0.0001);3個試驗組及PBS+佐劑組在第3 w均極顯著升高(p0.0001),此后有所下降。人工感染弓形蟲強毒株后,3個對照組小鼠均在第7 d-第9 d之間全部死亡,rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A+rSRS47D免疫組分別在第8 d-第10 d、第9 d-第12 d、第11 d-第15 d死亡,存活時間上存在顯著差異(p0.05)。提示rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A+rSRS47D均具有不同程度的免疫保護效果。綜上所述,本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了弓形蟲表面抗原糖蛋白相關(guān)序列SRS47D蛋白的結(jié)構(gòu)和潛在功能;體外重組表達了SRS47D蛋白;發(fā)現(xiàn)SRS47D蛋白主要分布于弓形蟲速殖子表面,尤其是前部和后部表膜;SRS47D與SRS37A蛋白之間存在互作關(guān)系,且SRS47D的兩個結(jié)構(gòu)域與SRS37A的兩個結(jié)構(gòu)域之間存在緊密的兩兩互作關(guān)系;rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A與rSRS47D聯(lián)合免疫對小鼠弓形蟲感染存在部分保護效果。研究結(jié)果為深入了解弓形蟲表面抗原糖蛋白相關(guān)序列SRS47D的功能和特性、利用該分子開展弓形蟲病防控新策略研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.72
【圖文】：

碩士學(xué)位論文 第二章 剛地弓形蟲表面抗原糖蛋白相關(guān)序列 SRS47D 的生水性分析小調(diào)整為 11（默認為 9）時，ProtScale 輸出圖形顯示，SRS47D 存在1.5）峰，分別位于 20-29、313-315、362-369 氨基酸殘基處，最高峰值處。而 14 個低分值（scare<0）峰位分別位于第 9-12、14-15、37-38、52、155-180、190-204、208-221、230-249、261-265、277-307、319-3值位于第 325 位的脯氨酸。（圖 2.1）

圖 2.2 蛋白信號肽分析Fig 2.2 Protein signal peptide analysisS47D 蛋白序列前 70 個位氨基酸殘基；Y 軸為計分（score）；C 值表示剪切位點號肽計分，用綠色顯示；Y 值是基于 S 值和 C 值的綜合計分值，用藍色表示。is showed the amino acid residues in the first 70 positions of the SRS47D sequence. The. C value indicated the scores of the shearing site, marked in red. S value presented tere displayed in green. The Y value were a comprehensive scores based on the S valueue.后蛋白修飾位點預(yù)測化修飾位點分析，當(dāng)給定閾值大于 90%時，預(yù)測結(jié)果顯示有 25 個絲氨酶位點，0 個酪氨酸激酶位點，0 個組氨酸激酶位點。25 個絲氨酸激酶激酶位點，分別位于第 213 位和 346 位氨基酸殘基，有 3 個 Auated kinase，Aurora）的磷酸激酶位點；其余 20 個均為共濟失調(diào)癥突變 mutated，ATM）磷酸激酶位點。Ac 糖基化位點分析，當(dāng)給定閾值大于 90%時，預(yù)測結(jié)果顯示在 173 位

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本文編號：2734988