【摘要】：禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的,屬于正粘病毒科,負(fù)鏈單股RNA病毒,普遍存在于禽類(lèi)、人類(lèi)及其他的動(dòng)物中,血凝素是禽流感疫苗重要的蛋白質(zhì),是亞單位疫苗中常用的抗原成分。本試驗(yàn)中H5HA10由H5N1(內(nèi)蒙古/10/2009由部分)亞型流感病毒血凝素基因經(jīng)設(shè)計(jì)后截短的片段,該片段在血凝素抗原變異方面具有重要作用。試驗(yàn)將Spyligase技術(shù)應(yīng)用于禽流感亞單位疫苗的表面抗原H5HA10的高效制備,將H5HA10序列的兩端分別加上Spy Tag和KTag,命名為Spy-H5HA10,利用Spyligase技術(shù)將其形成多聚體蛋白,增加H5HA10的穩(wěn)定性。構(gòu)建九個(gè)帶有不同可溶性標(biāo)簽的Spy-H5HA10重組表達(dá)載體,分別在大腸桿菌中表達(dá),選擇表達(dá)量高的重組蛋白。將Spyligase連接在帶有His-Cherry標(biāo)簽的p ET21b載體上,在大腸桿菌中表達(dá)。首先,使用Bam H I和Xho I雙酶切獲得目的基因Spy-H5HA10,將其連接在九種帶有不同促溶性標(biāo)簽的載體上,分別將其轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21感受態(tài)細(xì)胞中,Xho I和Nde I雙酶切鑒定正確后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)融合蛋白的表達(dá)量和可溶性進(jìn)行分析,篩選出表達(dá)量高可溶性好的促溶標(biāo)簽,其中p ET21b-His-Ars C-H5HA10蛋白的可溶性表達(dá)水平超過(guò)了95%。用同樣的方法,Nhe I和Xho I雙酶切獲得目的基因Spyligase,將其連接在帶有His-Cherry的可溶性標(biāo)簽的p ET21b載體上,轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中,Xho I和Nde I雙酶切鑒定正確后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),通過(guò)SDS-PAGE電泳分析其融合蛋白的表達(dá)量和可溶性,其表達(dá)量高可溶性好。其次,將p ET21b-His-Ars C-H5HA10和p ET21b-His-Cherry-Spyligas通過(guò)Ni-NTA Agarose親和純化,并獲得了高純度的Spy-H5HA10和Spyligase重組蛋白。最后,將獲得高純度的Spy-H5HA10與Spyligase混合后,在4℃PCT緩沖液中反應(yīng),通過(guò)SDS-PAGE電泳分析Spy-H5HA10形成單聚體,二聚體甚至是多聚體。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了九種不同促溶性標(biāo)簽的H5HA10的重組載體,一種含有可溶性標(biāo)簽的Spyligase重組載體;摸索并成功地獲得高純度的重組蛋白;重組蛋白形成多聚體蛋白;探究Spyligase技術(shù)的實(shí)用性,為禽流感亞單位疫苗的后續(xù)研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4
【圖文】：

圖 1 試驗(yàn)中構(gòu)建成功的表達(dá)載體Fig.1 Constructing successful expression vectors.1.1 十種重組表達(dá)載體的酶切獲得BamH I 和 Xho I 雙酶切獲得了含有九種可溶性標(biāo)簽的 pET21b 載體線性片is6-pAs200、His-XTEN、His6-ArsC、His6-PEAT 、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、Si

圖 2 BamH I 和 Xho I 雙酶切獲得載體Fig.2 Get vectors by Xho I and BamH INA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-9. pET21b-His-ArsC、pET21b-His-pAs200、pET21b-His-Xis-PEAT-、pET21b-SiTag3-SUMO、pET21b-SiTag3-MBP、pET21b-SiTag3-pAs200、Tag3-XTEN 和 pET21b-SiTag3-AesC 經(jīng) BamH I 和 Xho I 雙酶切獲得含有目標(biāo)可溶標(biāo)簽

【參考文獻(xiàn)】

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1 唐玉林;米子嵐;鐘活權(quán);江年瓊;;利用SUMO技術(shù)表達(dá)可溶性的擬南芥AtRD22蛋白[J];深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版);2015年06期

2 蔣文明;劉朔;陳繼明;;當(dāng)前我國(guó)禽流感流行情況分析[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2015年01期

3 蘇楠;吳敬君;李曄;張

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