【摘要】：乳脂是一種高質(zhì)量的天然脂肪,是牛乳的主要營養(yǎng)成分。乳脂率是衡量牛奶品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo),也是制約中國奶業(yè)發(fā)展的重要因素。近年來,奶牛的產(chǎn)奶量日益提高,但乳脂率卻未見增長。通常情況下牛奶的乳脂率為3%~4%,產(chǎn)奶量與乳脂率之間呈相互制約關(guān)系,如何提高乳脂率一直是學(xué)者們研究的熱點。研究表明日糧營養(yǎng)素可以通過調(diào)節(jié)基因的表達參與乳脂合成的調(diào)節(jié)。乙酸(acetate)和β-羥基丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)是泌乳奶牛乳腺中脂肪酸從頭合成的前體物質(zhì),體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中添加乙酸和BHBA可以提高細(xì)胞內(nèi)甘油三脂的合成。但乙酸和BHBA調(diào)控乳脂合成分子機制的研究還不十分明確。誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的DFF45樣因子C(Cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector c,CIDEC)是一種脂滴表面蛋白,可促進脂肪的儲存和脂滴的發(fā)育,進而維持機體平衡和能量代謝。實驗室前期結(jié)果表明CIDEC可以調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中乳脂的合成,但具體調(diào)節(jié)途徑還不明確。脂肪酸從頭合成過程主要由脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FASN)催化。為探討在乙酸和BHBA作用下,CIDEC與FASN表達以及乳脂合成之間的關(guān)系,本研究首先利用消化法獲取純化的BMECs,在8 mmol/L乙酸鈉和1 mmol/L BHBA作用下,采用Western blot方法研究了乳脂合成前體物調(diào)節(jié)CIDEC表達的信號通路,結(jié)果顯示添加8 mmol/L乙酸鈉和1mmol/L BHBA能明顯上調(diào)mTOR信號通路下游分子p-4EBP1和p-P70S6K的表達;降低pAMPKα的表達,提示在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,乳脂合成前體物可通過激活mTOR信號通路和AMPK信號通路調(diào)節(jié)CIDEC的表達。隨后我們采用基因干擾和過表達的方法研究在乳脂合成前體物刺激下,CIDEC對FASN表達及乳脂合成的影響,結(jié)果顯示CIDEC基因過表達后,奶牛乳腺上皮細(xì)胞中FASN蛋白水平和mRNA水平的表達顯著升高(p0.01),細(xì)胞內(nèi)TAG含量和脂滴數(shù)目增加。CIDEC基因干擾后,FASN蛋白水平和mRNA水平表達顯著降低(p0.05),細(xì)胞內(nèi)TAG含量降低,脂滴數(shù)目減少。這些結(jié)果表明CIDEC能夠正向調(diào)節(jié)FASN的表達,進而影響乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成。為研究CIDEC基因?qū)ASN轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),我們首先對FASN啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在FASN啟動子區(qū)存在潛在的C/EBPβ結(jié)合位點。采用基因干擾和過表達技術(shù)研究C/EBPβ對FASN表達及乳脂合成的影響,結(jié)果顯示C/EBPβ基因過表達后,奶牛乳腺上皮細(xì)胞中FASN mRNA和蛋白水平的表達顯著升高(p0.01),細(xì)胞內(nèi)TAG含量增加。C/EBPβ基因干擾后,細(xì)胞內(nèi)FASN mRNA和蛋白水平表達顯著降低(p0.01),細(xì)胞內(nèi)TAG含量降低。這些結(jié)果進一步證明C/EBPβ對FASN的轉(zhuǎn)錄具有正向調(diào)節(jié)作用,進而影響乳脂合成。隨后我們采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)和點突變的方法對FASN啟動子區(qū)C/EBPβ的結(jié)合位點進行驗證,結(jié)果顯示C/EBPβ結(jié)合的FASN啟動子區(qū)域在-110 bp~-50 bp區(qū)段。最后為研究CIDEC是否通過C/EBPβ調(diào)節(jié)FASN的轉(zhuǎn)錄,我們采用轉(zhuǎn)染技術(shù)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達CIDEC,同時干擾C/EBPβ的表達。TAG含量測定顯示奶牛乳腺上皮細(xì)胞中干擾C/EBPβ的表達可以降低由CIDEC過表達誘導(dǎo)的乳脂合成;qPCR結(jié)果也顯示干擾C/EBPβ的表達會降低由CIDEC過表達誘導(dǎo)的FASN mRNA的表達水平。綜合以上結(jié)果,在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,CIDEC可以通過與C/EBPβ作用,調(diào)節(jié)FASN的轉(zhuǎn)錄,進而影響乳脂的合成過程。該研究結(jié)果可以豐富泌乳奶牛乳腺中乳脂合成的分子機理,為通過分子手段提高奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益提供有價值的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

的發(fā)育、分化和增殖都是十分重要的。節(jié)乳脂合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路脂合成的過程中，大量的基因要參與進來，其特點是復(fù)雜且動態(tài)性強。而相互作用機理，可使人們更好地掌握人工調(diào)控乳脂合成。哺乳動物雷帕霉mmalian target of rapamycin，mTOR）信號通路[55]，在眾多的信號通路中起[38]。mTOR 是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于 PIKK 超家族[54]。其他蛋白結(jié)合，形成兩個復(fù)合體，即 mTORC1（mTOR complex 1）和 mTOR2）。這兩種復(fù)合物之間的關(guān)鍵差異之一是：mTOR 在 mTORC1 和 mTOR raptor和蛋白質(zhì)rictor相結(jié)合[55-56]。mTORC1復(fù)合體包括RAPTOR、mLST8這種復(fù)合體可以調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝[57]。研究表明，mTOR 在細(xì)胞增殖、分、蛋白質(zhì)的合成和基因的轉(zhuǎn)錄過程中伴有重要角色[58-59]。許多研究 mTOR 信號通路與脂質(zhì)代謝的關(guān)系，都集中在非反芻動物和各種報道了 mTOR對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳脂合成具有的調(diào)控作用[60-61可以感知營養(yǎng)和生長因子信號，參與乳脂合成在內(nèi)的合成代謝的調(diào)節(jié)[62-6明，mTORC1 的激活可以提高 PPARγ 和 C/EBPα mRNA 和蛋白水平的表成相關(guān)基因的表達[64-65]。在小鼠中抑制 mTORC1 活性，可削弱脂肪生成

圖 2-1 脂類抽提流程圖Fig.2-1 The flow chart of lipid extraction（2）TAG 含量檢測[72]1）將 TAG 試劑盒中 4 倍 T1 和 1 倍 T2 進行混勻，制備工作液。2）用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋為 15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000 μM3）分別將工作液與蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品進行混勻。4）37℃搖床慢搖 15 min，將待測樣品置于波長為 550 nm 的酶標(biāo)儀中檢測。5）讀取實驗數(shù)值，并制作出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。6）從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查找待測樣品中 TAG 含量。.3.2 mTOR 信號通路對 CIDEC 表達的影響在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中加入一定濃度比列脂類合成前體物質(zhì)（濃度同 2.3.1），培養(yǎng)細(xì)8 h 后，采用 Western blot 方法檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞中 FASN、ACC、CIDEC、mTOR 磷及 mTORC1 下游信號分子的表達。除 β-actin（內(nèi)參）抗體為鼠源，1：200 稀釋。其他抗為兔源，1：1000 稀釋。Western blot 實驗步驟如下：（1）奶牛乳腺細(xì)胞總蛋白提取細(xì)胞處理方法同 2.3.1。48 h 后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。具體實驗步驟如下：

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本文編號：2732508