【摘要】：乳脂是一種高質(zhì)量的天然脂肪,是牛乳的主要營養(yǎng)成分。乳脂率是衡量牛奶品質(zhì)優(yōu)劣的關鍵指標,也是制約中國奶業(yè)發(fā)展的重要因素。近年來,奶牛的產(chǎn)奶量日益提高,但乳脂率卻未見增長。通常情況下牛奶的乳脂率為3%~4%,產(chǎn)奶量與乳脂率之間呈相互制約關系,如何提高乳脂率一直是學者們研究的熱點。研究表明日糧營養(yǎng)素可以通過調(diào)節(jié)基因的表達參與乳脂合成的調(diào)節(jié)。乙酸(acetate)和β-羥基丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)是泌乳奶牛乳腺中脂肪酸從頭合成的前體物質(zhì),體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中添加乙酸和BHBA可以提高細胞內(nèi)甘油三脂的合成。但乙酸和BHBA調(diào)控乳脂合成分子機制的研究還不十分明確。誘導細胞調(diào)亡的DFF45樣因子C(Cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector c,CIDEC)是一種脂滴表面蛋白,可促進脂肪的儲存和脂滴的發(fā)育,進而維持機體平衡和能量代謝。實驗室前期結(jié)果表明CIDEC可以調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中乳脂的合成,但具體調(diào)節(jié)途徑還不明確。脂肪酸從頭合成過程主要由脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FASN)催化。為探討在乙酸和BHBA作用下,CIDEC與FASN表達以及乳脂合成之間的關系,本研究首先利用消化法獲取純化的BMECs,在8 mmol/L乙酸鈉和1 mmol/L BHBA作用下,采用Western blot方法研究了乳脂合成前體物調(diào)節(jié)CIDEC表達的信號通路,結(jié)果顯示添加8 mmol/L乙酸鈉和1mmol/L BHBA能明顯上調(diào)mTOR信號通路下游分子p-4EBP1和p-P70S6K的表達;降低pAMPKα的表達,提示在奶牛乳腺上皮細胞中,乳脂合成前體物可通過激活mTOR信號通路和AMPK信號通路調(diào)節(jié)CIDEC的表達。隨后我們采用基因干擾和過表達的方法研究在乳脂合成前體物刺激下,CIDEC對FASN表達及乳脂合成的影響,結(jié)果顯示CIDEC基因過表達后,奶牛乳腺上皮細胞中FASN蛋白水平和mRNA水平的表達顯著升高(p0.01),細胞內(nèi)TAG含量和脂滴數(shù)目增加。CIDEC基因干擾后,FASN蛋白水平和mRNA水平表達顯著降低(p0.05),細胞內(nèi)TAG含量降低,脂滴數(shù)目減少。這些結(jié)果表明CIDEC能夠正向調(diào)節(jié)FASN的表達,進而影響乳腺上皮細胞中乳脂合成。為研究CIDEC基因?qū)ASN轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),我們首先對FASN啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測,發(fā)現(xiàn)在FASN啟動子區(qū)存在潛在的C/EBPβ結(jié)合位點。采用基因干擾和過表達技術研究C/EBPβ對FASN表達及乳脂合成的影響,結(jié)果顯示C/EBPβ基因過表達后,奶牛乳腺上皮細胞中FASN mRNA和蛋白水平的表達顯著升高(p0.01),細胞內(nèi)TAG含量增加。C/EBPβ基因干擾后,細胞內(nèi)FASN mRNA和蛋白水平表達顯著降低(p0.01),細胞內(nèi)TAG含量降低。這些結(jié)果進一步證明C/EBPβ對FASN的轉(zhuǎn)錄具有正向調(diào)節(jié)作用,進而影響乳脂合成。隨后我們采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)和點突變的方法對FASN啟動子區(qū)C/EBPβ的結(jié)合位點進行驗證,結(jié)果顯示C/EBPβ結(jié)合的FASN啟動子區(qū)域在-110 bp~-50 bp區(qū)段。最后為研究CIDEC是否通過C/EBPβ調(diào)節(jié)FASN的轉(zhuǎn)錄,我們采用轉(zhuǎn)染技術在奶牛乳腺上皮細胞中過表達CIDEC,同時干擾C/EBPβ的表達。TAG含量測定顯示奶牛乳腺上皮細胞中干擾C/EBPβ的表達可以降低由CIDEC過表達誘導的乳脂合成;qPCR結(jié)果也顯示干擾C/EBPβ的表達會降低由CIDEC過表達誘導的FASN mRNA的表達水平。綜合以上結(jié)果,在奶牛乳腺上皮細胞中,CIDEC可以通過與C/EBPβ作用,調(diào)節(jié)FASN的轉(zhuǎn)錄,進而影響乳脂的合成過程。該研究結(jié)果可以豐富泌乳奶牛乳腺中乳脂合成的分子機理,為通過分子手段提高奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益提供有價值的實驗基礎和理論依據(jù)。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

的發(fā)育、分化和增殖都是十分重要的。節(jié)乳脂合成的信號轉(zhuǎn)導通路脂合成的過程中，大量的基因要參與進來，其特點是復雜且動態(tài)性強。而相互作用機理，可使人們更好地掌握人工調(diào)控乳脂合成。哺乳動物雷帕霉mmalian target of rapamycin，mTOR）信號通路[55]，在眾多的信號通路中起[38]。mTOR 是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于 PIKK 超家族[54]。其他蛋白結(jié)合，形成兩個復合體，即 mTORC1（mTOR complex 1）和 mTOR2）。這兩種復合物之間的關鍵差異之一是：mTOR 在 mTORC1 和 mTOR raptor和蛋白質(zhì)rictor相結(jié)合[55-56]。mTORC1復合體包括RAPTOR、mLST8這種復合體可以調(diào)節(jié)細胞新陳代謝[57]。研究表明，mTOR 在細胞增殖、分、蛋白質(zhì)的合成和基因的轉(zhuǎn)錄過程中伴有重要角色[58-59]。許多研究 mTOR 信號通路與脂質(zhì)代謝的關系，都集中在非反芻動物和各種報道了 mTOR對奶牛乳腺上皮細胞增殖和乳脂合成具有的調(diào)控作用[60-61可以感知營養(yǎng)和生長因子信號，參與乳脂合成在內(nèi)的合成代謝的調(diào)節(jié)[62-6明，mTORC1 的激活可以提高 PPARγ 和 C/EBPα mRNA 和蛋白水平的表成相關基因的表達[64-65]。在小鼠中抑制 mTORC1 活性，可削弱脂肪生成

圖 2-1 脂類抽提流程圖Fig.2-1 The flow chart of lipid extraction（2）TAG 含量檢測[72]1）將 TAG 試劑盒中 4 倍 T1 和 1 倍 T2 進行混勻，制備工作液。2）用蒸餾水將標準品濃度稀釋為 15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000 μM3）分別將工作液與蒸餾水，標準品和待測樣品進行混勻。4）37℃搖床慢搖 15 min，將待測樣品置于波長為 550 nm 的酶標儀中檢測。5）讀取實驗數(shù)值，并制作出相應的標準曲線。6）從標準曲線上可查找待測樣品中 TAG 含量。.3.2 mTOR 信號通路對 CIDEC 表達的影響在奶牛乳腺上皮細胞中加入一定濃度比列脂類合成前體物質(zhì)（濃度同 2.3.1），培養(yǎng)細8 h 后，采用 Western blot 方法檢測奶牛乳腺上皮細胞中 FASN、ACC、CIDEC、mTOR 磷及 mTORC1 下游信號分子的表達。除 β-actin（內(nèi)參）抗體為鼠源，1：200 稀釋。其他抗為兔源，1：1000 稀釋。Western blot 實驗步驟如下：（1）奶牛乳腺細胞總蛋白提取細胞處理方法同 2.3.1。48 h 后收集細胞，提取細胞總蛋白。具體實驗步驟如下：

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 崔新潔;王婷;劉秉春;陶林;王瀟;;牛奶中乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];生物技術通報;2013年03期

2 崔新潔;胡慶亮;李奕平;陶琳;修磊;劉秉春;陳媛;王瀟;;金黃色葡萄球菌誘導牛原代乳腺上皮細胞的凋亡[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2013年15期

3 李吉霞;葛秀國;王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

4 李瑞國;苗朝華;安曉榮;陳永福;;牛乳腺上皮細胞體外分離、培養(yǎng)和鑒定的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科技導報;2010年04期

5 宋亞男;陳志偉;劉東武;;牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系研究進展[J];生命科學儀器;2008年09期

6 張騫;顧小衛(wèi);;乳腺上皮細胞的研究及應用[J];中國牧業(yè)通訊;2008年21期

7 王治國;卜登攀;王加啟;;牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的檢測及核型分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2007年02期

8 胡艷秋;譚立新;羅淑萍;牛志剛;李文蓉;;β-酪蛋白基因在不同乳腺上皮細胞中表達的初步分析[J];新疆農(nóng)業(yè)大學學報;2006年02期

9 占今舜;劉明美;詹康;趙國琦;;苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成的影響[J];中國畜牧雜志;2017年01期

10 邢媛媛;李紅磊;李大彪;胡紅蓮;張興夫;高民;;油酸對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)甘油三酯含量和乳脂肪合成相關基因表達的影響[J];中國畜牧雜志;2017年07期

相關會議論文 前10條

1 田甜;李鍵;畢琳;梁天宇;王中乾;;激素和生長因子對牦牛乳腺上皮細胞生長的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)產(chǎn)科學分會第五屆全體會議第十次學術研討會論文集[C];2009年

2 李冬輝;林葉;高學軍;王春梅;張莉;李慶章;;催乳素、雌激素和胰島素對奶牛乳腺上皮細胞中瘦素及其受體的影響[A];全國動物生理生化第十二次學術交流會論文摘要匯編[C];2012年

3 金永成;張晶;牛淑玲;周長海;李洪求;;反式油酸和共軛亞油酸對牛乳腺上皮細胞中蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶基因表達的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物營養(yǎng)學分會第十一次全國動物營養(yǎng)學術研討會論文集[C];2012年

4 歐陽五慶;錢菊汾;;山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系的建立及cAMP對該細胞的影響[A];中國細胞生物學學會第七次會議論文摘要匯編[C];1999年

5 王月影;王艷玲;楊國宇;;乳腺上皮細胞鈣轉(zhuǎn)運機制研究進展[A];全國動物生理生化第十次學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

6 丁月云;包紅朵;周芬;張莉莉;王恬;;黃芪、王不留行對奶牛乳腺上皮細胞體外分泌性能影響的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物營養(yǎng)學分會第十次學術研討會論文集[C];2008年

7 萬中英;高學軍;佟慧麗;李慶章;;王不留行增乳活性成分對奶牛乳腺上皮細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的影響[A];全國動物生理生化第十一次學術交流會論文摘要匯編[C];2010年

8 童津津;曲波;高學軍;王春梅;張莉;林葉;李慶章;;奶牛乳腺上皮細胞E-cadherin/Beta-catenin的定位及表達[A];全國動物生理生化第十二次學術交流會論文摘要匯編[C];2012年

9 王佳麗;高學軍;李慶章;王春梅;張莉;林葉;;蛋氨酸對奶牛乳腺上皮細胞亞細胞器蛋白質(zhì)組學影響[A];全國動物生理生化第十二次學術交流會論文摘要匯編[C];2012年

10 歐陽五慶;;山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系的建立[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2001年

相關重要報紙文章 前1條

1 陸志城;ＡＢＣＧ２“排毒”亦“吸毒”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

相關博士學位論文 前10條

1 駱超超;奶牛乳腺上皮細胞Sestrin 2基因在氨基酸調(diào)控酪蛋白合成中的作用機制[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2018年

2 霍楠;PURB在氨基酸調(diào)節(jié)BMECs乳合成中的作用和分子機理[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2018年

3 孫雨婷;短鏈脂肪酸受體GPR41基因在奶山羊乳腺上皮細胞脂代謝中的作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

4 張?zhí)旆f;反10、順12共軛亞油酸（Trans10,Cis12-CLA）對奶山羊乳腺上皮細胞脂代謝的調(diào)控作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2018年

5 吳瓊;乳酸桿菌減輕大腸桿菌誘發(fā)奶牛乳腺上皮細胞炎性損傷的機理[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2018年

6 代文婷;SARS介導蛋氨酸調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白合成的機制研究[D];浙江大學;2018年

7 孫宇;重組牛脂多糖結(jié)合蛋白對脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應的影響及其機制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 鄭月茂;轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞系建立與轉(zhuǎn)基因克隆胚發(fā)育[D];西北農(nóng)林科技大學;2005年

9 杜娟;奶牛乳腺上皮細胞高溫應答機制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2007年

10 劉立新;14-3-3γ調(diào)控脂多糖誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應和泌乳[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2016年

相關碩士學位論文 前10條

1 單旭菲;PRL抵抗在LPS導致BMEC乳蛋白合成功能降低中的作用[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2019年

2 趙文蘋;LPS刺激奶牛乳腺上皮細胞后外泌體的分離鑒定及miRNA分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2019年

3 湯云飛;MMP9對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的作用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2019年

4 呂賀;CIDEC對奶牛乳腺上皮細胞中FASN表達的調(diào)控研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2019年

5 李玉丹;抑制p38MAPK信號通路對熱處理奶牛乳腺上皮細胞蛋白差異表達的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2017年

6 李媛;腺病毒介導人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮細胞的表達[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

7 王希希;LncRNA LRRC75A-AS1對奶牛乳腺上皮細胞的生物學特性及功能的影響[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

8 車滟翼;IFN-γ增強奶牛乳腺上皮細胞對金黃色葡萄球菌易感性的機制研究[D];吉林大學;2018年

9 張亞林;不同蛋氨酸源對豬乳腺上皮細胞蛋白質(zhì)合成的調(diào)控及其機制研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2016年

10 經(jīng)語佳;節(jié)律基因PER2沉默對奶牛乳腺上皮細胞增殖及乳脂合成的影響[D];揚州大學;2018年

本文編號：2732508