發(fā)布時間：2020-06-28 03:52

【摘要】：2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)不僅可以感染仔豬,也可以感染人類,是危害養(yǎng)豬業(yè)及其從業(yè)相關人員的重要的人畜共患病病原體。豬鏈球菌病已經出現40多年了,但是到目前為止仍不斷有新的感染病例出現,且在東南亞等國,該疾病的流行趨勢沒有減弱。中國曾經爆發(fā)了兩次大規(guī)模的人感染豬鏈球菌的群體公共衛(wèi)生事件,且多數患者因細菌感染而引發(fā)了中毒性休克綜合征(streptococcal toxic shock syndrome,STSS),從而無法扭轉病程,最終62.7%~81.3%的患者死亡。本課題組密切關注這兩次突發(fā)感染事件,從中分離到了導致這兩次疾病流行的高致病性2型豬鏈球菌,S.suis 98HAH12和S.suis 05ZYH33,并對其進行了詳細的生物學特性研究和基因組學特性分析。其中,我們確定高致病性2型豬鏈球菌所特有的一個大小約為89 kb的致病島(89K pathogenicity island,89K PAI),是導致這兩次疾病流行致死率較高的主要原因,且89K PAI上含有毒力因子(virulence-associated factor,VAF)、二元信號轉導系統(two-component signal transduction system,TCSTS)和四型分泌系統(type IV secretion system,T4SS)等與細菌致病性密切相關的基因元件。已鑒定出的豬鏈球菌的毒力因子有20多個,其中最主要的是莢膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和豬鏈球菌溶血素(suilysin,SLY),CPS不僅可以為細菌提供保護屏障,還參與細菌對宿主細胞的抗吞噬能力;SLY可以增加細菌密度,促進細菌引發(fā)宿主炎癥反應。其他毒力因子也參與到細菌與宿主的相互作用和促進細菌透過宿主的血腦屏障等。但是,豬鏈球菌毒力的來源及分化尚不清楚,尋找有效的預防手段是防治豬鏈球菌病的長遠目標。因此本課題以從流行區(qū)豬群中分離到的一株不致病的2型豬鏈球菌為研究基礎,通過對其進行生物學特性鑒定、全基因組測序和比較基因組學分析,探討豬鏈球菌各菌株之間毒力演化和基因組重排的方式,探索可以預防該疾病的疫苗。主要研究內容和實驗結果如下:1.2型豬鏈球菌05HAS68生物學特性的鑒定:分別對細菌進行培養(yǎng)觀察和革蘭染色,用分光光度計法測定細菌的溶血活性,列舉活菌數目測定細菌的全血存活能力。用流式細胞儀測定細菌對Hep-2細胞的粘附能力,用梅里埃生化檢測卡鑒定細菌的生化反應類型。通過以上實驗我們確定S.suis 05HAS68與高致病性菌株S.suis 05ZYH33相比,是一株具有較高粘附能力但溶血活性較差的血清2型豬鏈球菌。進一步利用16S r RNA基因分型和多位點序列分型,證明該菌株屬于豬鏈球菌屬,ST28型。2.2型豬鏈球菌05HAS68全基因組測序及全基因組注釋:利用二代測序技術Ion torrent PGM測序儀,分別構建待測基因組的測序文庫,其中Mate-pair 4 kb庫和shotgun小片段隨機庫分別達到127×和114×的測序覆蓋度。采用Newbler v2.8和CLC Genomics Workbench對測序reads進行拼接后得到S.suis 05HAS68的全基因組序列長度為2,176,073 bp。通過RAST在線注釋和比對BLAST、COG、KEGG數據庫對S.suis05HAS68進行全基因組注釋。利用DNAStar軟件包、CGView Server、t RNAScan-SE 1.21和RNAmmer 1.2,分析S.suis 05HAS68基因組的一般特性。注釋及分析結果顯示,S.suis 05HAS68基因組的GC含量為41.2%,共編碼2009個基因,另外還編碼56個t RNA基因和12個r RNA基因。3.2型豬鏈球菌05HAS68與有毒株的比較基因組學分析:采用比對毒力因子數據庫和BLASTp比對的方法,鑒定S.suis 05HAS68基因組上存在的VAF和TCSTS。通過Island Viewer、CRISPRfinder和Prophage Finder鑒定S.suis 05HAS68基因組上可能的基因組島、CRISPR結構和前噬菌體結構。利用ACT和Mauve軟件分析S.suis05HAS68與其他豬鏈球菌基因組大規(guī)模重排的方式和規(guī)律。我們發(fā)現S.suis 05HAS68與S.suis 05ZYH33和S.suis 98HAH12共有1751個基因,但是S.suis 05HAS68特有253個基因。其中包括1個CRISPR結構、4個前噬菌體結構和1個113K代謝島(半乳糖代謝途徑和巖藻糖代謝途徑)。S.suis 05HAS68基因組中缺少重要的VAF,例如SLY、MRP、EPF和毒力相關蛋白E等,Sal K/Sal R、Nis K/Nis R、Vir R/Vir S和Rev S等毒力相關的TCSTS在S.suis 05HAS68基因組中也是缺失的。S.suis 05HAS68基因組與其他豬鏈球菌基因組之間存在由轉座酶和前噬菌體介導的大規(guī)�；蚪M重排,且重排圍繞基因組的復制軸(ori/ter axis)呈“X形”。4.89K PAI在S.suis各菌株中的分布情況及S.suis的系統發(fā)生分析:比對89K PAI序列在豬鏈球菌以及其他鏈球菌中的分布情況。在豬鏈球菌P1/7、A7、GZ1、S735、ST1和ST3菌株中沒有比對到89K PAI的同源序列,在豬鏈球菌SC84和BM407中比對到了絕大部分的89K PAI同源序列,其他豬鏈球菌中則比對到了一部分89K PAI同源片段,另外在無乳鏈球菌和肺炎鏈球菌中也比對到了部分89K PAI的同源序列。綜合評價用rpo B、16S r RNA、ITS(internal transcribed spacer)和core gene構建的系統發(fā)生樹,可以看出S.suis 05HAS68在進化關系上與高致病性2型豬鏈球菌相距較遠。5.2型豬鏈球菌05HAS68的毒力鑒定及免疫保護初探討:用同等劑量(1×108 CFU)的S.suis 05HAS68、高致病性菌株05ZYH33和98HAH12分別攻擊仔豬。攻毒實驗證明,S.suis 05HAS68對動物不具有致死性。分別用無毒株05HAS68和基因敲除改造的無毒株Δsal KR免疫仔豬2次后,再用高致病性菌株05ZYH33或98HAH12進行攻擊,觀察無毒株05HAS68對仔豬是否具有免疫保護作用。實驗結果顯示,事先用無毒株05HAS68免疫的動物可免受高致病性菌株的攻擊,但是用基因敲除改造的無毒株Δsal KR免疫的仔豬,不能抵抗高致病性菌株05ZYH33的攻擊,初步說明S.suis05HAS68對仔豬具有免疫保護效果。綜上所述,本研究成功的鑒定了一株無毒的2型豬鏈球菌05HAS68,并對其進行全基因組測序和比較基因組學分析。研究發(fā)現,S.suis 05HAS68與高致病性豬鏈球菌之間存在較大的毒力差異,且基因組間存在大規(guī)模重排,可能是由轉座酶和/或前噬菌體介導的。該無毒株有望成為預防豬鏈球菌病的疫苗候選株。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.611

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本文編號：2732518