【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)感染導(dǎo)致的人畜共患傳染病。臨床上主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、睪丸炎、關(guān)節(jié)痛等癥狀,對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失,同時嚴(yán)重威脅人類健康。巨噬細(xì)胞作為機體防御病原入侵和向免疫系統(tǒng)呈遞病原信息的細(xì)胞,是布魯氏菌侵染的主要靶細(xì)胞。布魯氏菌在感染宿主的過程中,細(xì)菌的外膜蛋白首先與巨噬細(xì)胞發(fā)生互作完成侵染過程,通過逃避機體免疫,在細(xì)胞中存活和繁殖,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。Omp25作為重要的毒力因子,在布魯氏菌感染致病過程中起著至關(guān)重要的作用。有研究報道,TNF-α作為免疫反應(yīng)重要的細(xì)胞因子,能夠有效地對抗機體布魯氏菌感染,布魯氏菌感染可抑制巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生,但Omp25對巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生是否有作用,其作用機制如何尚不明確。本研究擬以滅活的豬種布魯氏菌為模板,構(gòu)建Omp25和Omp31慢病毒表達(dá)載體,完成慢病毒的包裝和濃縮。然后,MTT確定慢病毒感染巨噬細(xì)胞的最佳濃度和時間,流式細(xì)胞術(shù)、Q-PCR檢測Omp25和Omp31對巨噬細(xì)胞周期和凋亡的影響。ELISA檢測Omp25對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響,雙熒光素酶、Q-PCR和western blotting確定參與調(diào)控TNF-α產(chǎn)生的miRNAs和參與調(diào)控TNF-α產(chǎn)生的關(guān)鍵信號通路。最后,明確Omp25對巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生的信號通路和miRNA的調(diào)控機制。研究結(jié)果將闡明Omp25對巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生的調(diào)控作用和機制,為進(jìn)一步探討布魯氏菌逃避宿主免疫反應(yīng)的機制提供理論依據(jù)。研究取得如下結(jié)果。1.PCR克隆Omp25和Omp31編碼基因,BamH I和EcoR I雙酶切后連接轉(zhuǎn)化Stabl3感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)鑒定和測序分析,篩選獲得正確的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-CMV-omp25-Flag-EF1-copGFP和pCDH-CMV-omp31-Flag-EF1-copGF。將慢病毒表達(dá)質(zhì)粒、被膜質(zhì)粒PMD2.G和骨架質(zhì)粒psPAX2共同轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,分別獲得Omp25和Omp31慢病毒(Lv-Omp25和Lv-Omp31),RT-PCR和western blotting檢測顯示慢病毒表達(dá)大小約為26 kDa Omp25和30 kDa Omp31。2.以不同濃度梯度和時間梯度的慢病毒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs),MTT結(jié)果顯示,Lv-Omp25和Lv-Omp31感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞活性沒有影響(p0.05),當(dāng)慢病毒以100 MOI濃度感染36 h時,顯微鏡觀察Omp25和Omp31在PAMs中均有表達(dá),且對細(xì)胞生長活性無顯著影響(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,與Lv-Blank相比,Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后細(xì)胞G0/G1、S以及G2/M期均未見顯著差異(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后巨噬細(xì)胞的凋亡率分別是10.3%、9.1%和10.3%,差異不顯著(p0.05)。3.Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31分別感染PAMs和RAW264.7,western blotting結(jié)果顯示,Omp25和Omp31能夠穩(wěn)定表達(dá);ELISA和Q-PCR檢測顯示,相比于Lv-Blank和Lv-Omp31,Lv-Omp25可以顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-12p40和IL-6表達(dá)(p0.01),但對IL-1β沒有顯著作用(p0.05),同時雙熒光素酶活性檢測顯示,Lv-Omp25可以顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α啟動子活性(p0.01)。4.Lv-Blank和Lv-Omp25分別感染PAMs和RAW264.7,Q-PCR檢測顯示,Omp25上調(diào)miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平(p0.05,p0.01)。轉(zhuǎn)染不同miRNAs mimics,ELISA和Q-PCR檢測顯示,miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b和miR-301a-3p顯著降低了LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生,miR-146a和miR-351-5p參與抑制TNF-α轉(zhuǎn)錄;western blotting檢測結(jié)果顯示,miR-146a mimics和miR-351-5p mimics顯著抑制TRAF6和IRAK1的表達(dá)(p0.05)。Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7,western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),Lv-Omp25感染的細(xì)胞TRAF6和IRAK1表達(dá)減少,而轉(zhuǎn)染miR-146a和miR-351-5p抑制劑則可上調(diào)TRAF6和IRAK1的表達(dá);Q-PCR檢測顯示,miR-146a和miR-351-5p抑制劑都可上調(diào)TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平(p0.05)。上述miRNA特異抑制劑轉(zhuǎn)染PAMs和RAW264.7后用Lv-Blank和Lv-Omp25感染細(xì)胞,ELISA檢測顯示,相對于非特異性miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞,特異性miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生水平顯著提高,同時miRNA特異性抑制劑混合轉(zhuǎn)染可使TNF-α的表達(dá)水平基本恢復(fù)到對照組水平(p0.05)。5.Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7發(fā)現(xiàn),Lv-Omp25感染可抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,同時Lv-Omp25能夠減少胞核中p65和胞質(zhì)p-IκB的表達(dá)(p0.05,p0.01),而對p50和IκB的表達(dá)沒有影響(p0.05)。miR-146a和miR-351-5p抑制劑轉(zhuǎn)染Lv-Omp25感染的細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PAMs中miR-146a抑制劑顯著增加p-IκB的水平;在RAW264.7細(xì)胞中,miR-146a和miR-351-5p抑制劑都能增加p-IκB的水平,而對IκB表達(dá)沒有影響。Lv-Omp25感染可增加JAK-2和SOCS1的表達(dá),降低SOCS3的表達(dá),同時降低p-STAT1的水平和上調(diào)p-STAT3的水平,而不影響JAK-1和JAK-3的表達(dá)。用JAK2-STAT3信號通路抑制劑處理Lv-Blank和Lv-Omp25感染的PAMs和RAW264.7,結(jié)果顯示,抑制JAK2-STAT3信號通路可顯著地抑制Lv-Omp25感染對TNF-α表達(dá)的抑制作用;此外,AG490可顯著抑制細(xì)胞Lv-Omp25誘導(dǎo)的miR-146a和miR-181a-5p水平,而對miR-130a-3p、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平?jīng)]有影響。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)Omp25和Omp31的慢病毒表達(dá)載體,獲得高滴度慢病毒。用包裝的慢病毒成功感染PAMs,并能穩(wěn)定表達(dá)Omp25和Omp31。Omp25和Omp31不參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞周期調(diào)控和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Omp25可顯著降低PAMs和RAW264.7 TNF-α、IL-12p40和IL-6的表達(dá),且Omp25可抑制TNF-α啟動子的活性,而Omp31沒有此作用。Omp25可上調(diào)與TNF-α抑制有關(guān)的miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平。其中miR-130a-3p、miR-181a和miR-301a-3p通過靶向TNF-α3'UTR直接抑制TNF-α的表達(dá),而miR-146a和miR-351-5p通過直接靶向TRAF6和IRAK1蛋白,進(jìn)而抑制TNF-α的轉(zhuǎn)錄。Omp25可通過上調(diào)miR-146a和miR-351-5p抑制NF-κB信號通路的活化,同時通過激活JAK2-STAT3信號通路上調(diào)miR-146a和miR-181a-5p進(jìn)而抑制TNF-α的表達(dá)。上述研究結(jié)果闡明了布魯氏菌Omp25抑制巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生的作用和調(diào)控機制,為更深入探討布魯氏菌逃避宿主免疫的機理奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖 2-1 PCR 擴增布魯氏菌 omp25 和 omp31A：omp25 PCR 擴增條帶；B：omp31 PCR 擴增條帶Fig. 2-1 Production of omp25 and omp31 PCRA: Production of omp25 PCR; B: Production of omp31 PC表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重 組 慢 病 毒 表 達(dá) 質(zhì) 粒 pCDH-CMV-omp25-Fl1-Flag-EF1-copGFP，分別得到了大小約為 666 bp、條帶（圖 2-2）。陽性質(zhì)粒送由上海生物工程有限公明重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pCDH-CMV-omp25-F1-Flag-EF1-copGFP 均構(gòu)建成功。

圖 2-1 PCR 擴增布魯氏菌 omp25 和 omp31A：omp25 PCR 擴增條帶；B：omp31 PCR 擴增條帶。Fig. 2-1 Production of omp25 and omp31 PCRA: Production of omp25 PCR; B: Production of omp31 PCR.表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重 組 慢 病 毒 表 達(dá) 質(zhì) 粒 pCDH-CMV-omp25-Flag-E1-Flag-EF1-copGFP，分別得到了大小約為 666 bp、747條帶（圖 2-2）。陽性質(zhì)粒送由上海生物工程有限公司測明重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pCDH-CMV-omp25-Flag-E1-Flag-EF1-copGFP 均構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 阮靜瑤;陳必成;張喜樂;張戎;黃歡捷;;巨噬細(xì)胞M1/M2極化的信號通路研究進(jìn)展[J];免疫學(xué)雜志;2015年10期

本文編號：2732349