【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)感染導致的人畜共患傳染病。臨床上主要表現(xiàn)為流產、死胎、睪丸炎、關節(jié)痛等癥狀,對畜牧業(yè)生產造成巨大的經濟損失,同時嚴重威脅人類健康。巨噬細胞作為機體防御病原入侵和向免疫系統(tǒng)呈遞病原信息的細胞,是布魯氏菌侵染的主要靶細胞。布魯氏菌在感染宿主的過程中,細菌的外膜蛋白首先與巨噬細胞發(fā)生互作完成侵染過程,通過逃避機體免疫,在細胞中存活和繁殖,導致疾病的發(fā)生。Omp25作為重要的毒力因子,在布魯氏菌感染致病過程中起著至關重要的作用。有研究報道,TNF-α作為免疫反應重要的細胞因子,能夠有效地對抗機體布魯氏菌感染,布魯氏菌感染可抑制巨噬細胞TNF-α的產生,但Omp25對巨噬細胞TNF-α的產生是否有作用,其作用機制如何尚不明確。本研究擬以滅活的豬種布魯氏菌為模板,構建Omp25和Omp31慢病毒表達載體,完成慢病毒的包裝和濃縮。然后,MTT確定慢病毒感染巨噬細胞的最佳濃度和時間,流式細胞術、Q-PCR檢測Omp25和Omp31對巨噬細胞周期和凋亡的影響。ELISA檢測Omp25對巨噬細胞產生TNF-α的影響,雙熒光素酶、Q-PCR和western blotting確定參與調控TNF-α產生的miRNAs和參與調控TNF-α產生的關鍵信號通路。最后,明確Omp25對巨噬細胞TNF-α產生的信號通路和miRNA的調控機制。研究結果將闡明Omp25對巨噬細胞TNF-α產生的調控作用和機制,為進一步探討布魯氏菌逃避宿主免疫反應的機制提供理論依據(jù)。研究取得如下結果。1.PCR克隆Omp25和Omp31編碼基因,BamH I和EcoR I雙酶切后連接轉化Stabl3感受態(tài)細胞,經鑒定和測序分析,篩選獲得正確的重組慢病毒表達質粒pCDH-CMV-omp25-Flag-EF1-copGFP和pCDH-CMV-omp31-Flag-EF1-copGF。將慢病毒表達質粒、被膜質粒PMD2.G和骨架質粒psPAX2共同轉染HEK-293T細胞,分別獲得Omp25和Omp31慢病毒(Lv-Omp25和Lv-Omp31),RT-PCR和western blotting檢測顯示慢病毒表達大小約為26 kDa Omp25和30 kDa Omp31。2.以不同濃度梯度和時間梯度的慢病毒感染豬肺泡巨噬細胞(PAMs),MTT結果顯示,Lv-Omp25和Lv-Omp31感染對豬肺泡巨噬細胞活性沒有影響(p0.05),當慢病毒以100 MOI濃度感染36 h時,顯微鏡觀察Omp25和Omp31在PAMs中均有表達,且對細胞生長活性無顯著影響(p0.05)。流式細胞術檢測細胞周期結果顯示,與Lv-Blank相比,Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后細胞G0/G1、S以及G2/M期均未見顯著差異(p0.05)。流式細胞術檢測細胞凋亡的結果顯示,Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后巨噬細胞的凋亡率分別是10.3%、9.1%和10.3%,差異不顯著(p0.05)。3.Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31分別感染PAMs和RAW264.7,western blotting結果顯示,Omp25和Omp31能夠穩(wěn)定表達;ELISA和Q-PCR檢測顯示,相比于Lv-Blank和Lv-Omp31,Lv-Omp25可以顯著下調LPS誘導的TNF-α、IL-12p40和IL-6表達(p0.01),但對IL-1β沒有顯著作用(p0.05),同時雙熒光素酶活性檢測顯示,Lv-Omp25可以顯著下調LPS誘導的TNF-α啟動子活性(p0.01)。4.Lv-Blank和Lv-Omp25分別感染PAMs和RAW264.7,Q-PCR檢測顯示,Omp25上調miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平(p0.05,p0.01)。轉染不同miRNAs mimics,ELISA和Q-PCR檢測顯示,miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b和miR-301a-3p顯著降低了LPS誘導的TNF-α產生,miR-146a和miR-351-5p參與抑制TNF-α轉錄;western blotting檢測結果顯示,miR-146a mimics和miR-351-5p mimics顯著抑制TRAF6和IRAK1的表達(p0.05)。Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7,western blotting檢測結果發(fā)現(xiàn),Lv-Omp25感染的細胞TRAF6和IRAK1表達減少,而轉染miR-146a和miR-351-5p抑制劑則可上調TRAF6和IRAK1的表達;Q-PCR檢測顯示,miR-146a和miR-351-5p抑制劑都可上調TNF-α的轉錄水平(p0.05)。上述miRNA特異抑制劑轉染PAMs和RAW264.7后用Lv-Blank和Lv-Omp25感染細胞,ELISA檢測顯示,相對于非特異性miRNA抑制劑轉染細胞,特異性miRNA抑制劑轉染的細胞中TNF-α的產生水平顯著提高,同時miRNA特異性抑制劑混合轉染可使TNF-α的表達水平基本恢復到對照組水平(p0.05)。5.Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7發(fā)現(xiàn),Lv-Omp25感染可抑制NF-κB轉錄活性,同時Lv-Omp25能夠減少胞核中p65和胞質p-IκB的表達(p0.05,p0.01),而對p50和IκB的表達沒有影響(p0.05)。miR-146a和miR-351-5p抑制劑轉染Lv-Omp25感染的細胞結果發(fā)現(xiàn),在PAMs中miR-146a抑制劑顯著增加p-IκB的水平;在RAW264.7細胞中,miR-146a和miR-351-5p抑制劑都能增加p-IκB的水平,而對IκB表達沒有影響。Lv-Omp25感染可增加JAK-2和SOCS1的表達,降低SOCS3的表達,同時降低p-STAT1的水平和上調p-STAT3的水平,而不影響JAK-1和JAK-3的表達。用JAK2-STAT3信號通路抑制劑處理Lv-Blank和Lv-Omp25感染的PAMs和RAW264.7,結果顯示,抑制JAK2-STAT3信號通路可顯著地抑制Lv-Omp25感染對TNF-α表達的抑制作用;此外,AG490可顯著抑制細胞Lv-Omp25誘導的miR-146a和miR-181a-5p水平,而對miR-130a-3p、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平沒有影響。本研究成功構建了表達Omp25和Omp31的慢病毒表達載體,獲得高滴度慢病毒。用包裝的慢病毒成功感染PAMs,并能穩(wěn)定表達Omp25和Omp31。Omp25和Omp31不參與調節(jié)巨噬細胞周期調控和誘導細胞凋亡的發(fā)生。Omp25可顯著降低PAMs和RAW264.7 TNF-α、IL-12p40和IL-6的表達,且Omp25可抑制TNF-α啟動子的活性,而Omp31沒有此作用。Omp25可上調與TNF-α抑制有關的miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平。其中miR-130a-3p、miR-181a和miR-301a-3p通過靶向TNF-α3'UTR直接抑制TNF-α的表達,而miR-146a和miR-351-5p通過直接靶向TRAF6和IRAK1蛋白,進而抑制TNF-α的轉錄。Omp25可通過上調miR-146a和miR-351-5p抑制NF-κB信號通路的活化,同時通過激活JAK2-STAT3信號通路上調miR-146a和miR-181a-5p進而抑制TNF-α的表達。上述研究結果闡明了布魯氏菌Omp25抑制巨噬細胞TNF-α產生的作用和調控機制,為更深入探討布魯氏菌逃避宿主免疫的機理奠定了基礎。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖 2-1 PCR 擴增布魯氏菌 omp25 和 omp31A：omp25 PCR 擴增條帶；B：omp31 PCR 擴增條帶Fig. 2-1 Production of omp25 and omp31 PCRA: Production of omp25 PCR; B: Production of omp31 PC表達質粒的鑒定 重 組 慢 病 毒 表 達 質 粒 pCDH-CMV-omp25-Fl1-Flag-EF1-copGFP，分別得到了大小約為 666 bp、條帶（圖 2-2）。陽性質粒送由上海生物工程有限公明重組慢病毒表達質粒 pCDH-CMV-omp25-F1-Flag-EF1-copGFP 均構建成功。

圖 2-1 PCR 擴增布魯氏菌 omp25 和 omp31A：omp25 PCR 擴增條帶；B：omp31 PCR 擴增條帶。Fig. 2-1 Production of omp25 and omp31 PCRA: Production of omp25 PCR; B: Production of omp31 PCR.表達質粒的鑒定 重 組 慢 病 毒 表 達 質 粒 pCDH-CMV-omp25-Flag-E1-Flag-EF1-copGFP，分別得到了大小約為 666 bp、747條帶（圖 2-2）。陽性質粒送由上海生物工程有限公司測明重組慢病毒表達質粒 pCDH-CMV-omp25-Flag-E1-Flag-EF1-copGFP 均構建成功。

【參考文獻】

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1 阮靜瑤;陳必成;張喜樂;張戎;黃歡捷;;巨噬細胞M1/M2極化的信號通路研究進展[J];免疫學雜志;2015年10期

本文編號：2732349