【摘要】：背景:玉米赤霉烯酮(ZEA)是一種具有雌激素活性的真菌毒素,主要作用于動(dòng)物生殖系統(tǒng),可導(dǎo)致家畜繁殖障礙,對(duì)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失;microRNA(miRNA)是真核生物體內(nèi)一段18-26bp的非編碼核苷酸片段,miRNA與機(jī)體的發(fā)育和生理學(xué)過程有著密切聯(lián)系。目的:本研究主要闡明miRNA是否參與ZEA在生殖細(xì)胞中毒理學(xué)的調(diào)控,并驗(yàn)證ZEA是否通過PI3K/AKT通路引起生殖細(xì)胞凋亡。方法:通過CCK-8試劑盒檢測ZEA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的最佳染毒濃度并計(jì)算半數(shù)致死濃度,建立ZEA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞染毒模型。通過TUNEL檢測ZEA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。分別提取空白組和ZEA染毒組的RNA,每組3個(gè)重復(fù)后進(jìn)行miRNA測序篩選差異表達(dá)的miRNA。通過RT-PCR驗(yàn)證miRNA測序結(jié)果。miRNA測序篩選出的PI3K/AKT信號(hào)通路通過構(gòu)建腺病毒載體干擾PTEN基因驗(yàn)證ZEA是否通過PI3K/AKT通路促進(jìn)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡,流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證小鼠睪丸細(xì)胞的凋亡情況。Western-blot驗(yàn)證PI3K/AKT通路中PTEN、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白的變化。結(jié)果:1.CCK-8試劑盒顯示隨著ZEA濃度的提高,小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長受到抑制,通過計(jì)算得出ZEA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為IC_(50)=53.33μmol/L。TUNEL的結(jié)果顯示當(dāng)以53.33μmol/LZEA處理小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡。2.miRNA測序結(jié)果顯示ZEA處理組和對(duì)照組相比,有197個(gè)miRNA顯著變化(p0.05),其中86個(gè)上調(diào),111個(gè)下調(diào)。通過生物信息學(xué)對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測并進(jìn)行GO和KEGG分析,篩選出了16個(gè)與ZEA毒理學(xué)相關(guān)的miRNA并繪制miRNA-靶基因-信號(hào)通路互作圖。miRNA-靶基因-信號(hào)通路互作圖表明Ras信號(hào)通路,Rap1信號(hào)通路,PI3K-AKT信號(hào)通路,Foxo信號(hào)通路,AMPK信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等通路與ZEA毒理學(xué)關(guān)系密切。之后通過RT—PCR驗(yàn)證miRNA和靶基因,其結(jié)果與測序結(jié)果一致。3.構(gòu)建腺病毒載體后,倒置熒光顯微鏡觀察攜帶GFP熒光增強(qiáng)標(biāo)簽的腺病毒轉(zhuǎn)染情況,判斷最適的multiplicity of infection(MOI)為50MOI。Western-blot結(jié)果顯示腺病毒有效的干擾了PTEN蛋白的表達(dá)。流失細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PTEN蛋白沉默后可抑制ZEA誘導(dǎo)的凋亡。ZEA組的PTEN、Bax蛋白和空白組相比顯著上調(diào)(p0.01)。ZEA組的AKT,p-AKT,Bcl-2蛋白和空白組相比顯著下調(diào)(p0.05)。NC+ZEA組和ZEA組蛋白表達(dá)基本一致。shRNA+ZEA組的PTEN、Bax蛋白和ZEA組相比顯著下調(diào)(p0.05),shRNA+ZEA組的AKT,p-AKT,Bcl-2蛋白和ZEA組相比顯著下調(diào)(p0.05)。結(jié)論:1、ZEA可以起小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡。ZEA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為IC_(50)=53.33μmol/L。2、ZEA染毒后TM3 Leydig細(xì)胞后有16個(gè)miRNA與ZEA的毒理學(xué)相關(guān)。GO富集分析和途徑相互作用分析表明,miRNA和靶基因與ZEN的毒理機(jī)制關(guān)系密切的通路有:Ras信號(hào)通路,Rap1信號(hào)通路,PI3K-AKT信號(hào)通路,Foxo信號(hào)通路,AMPK信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。3、ZEA可能通過對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。PTEN蛋白可能是ZEA作用于PI3K/AKT信號(hào)通路中一個(gè)重要靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S859.8
【圖文】：

1.1.1 ZEA的理化性質(zhì)玉米赤霉烯酮化學(xué)名為6-（10-羥基-6-氧代-1-十一碳烯基）-β-雷鎖酸內(nèi)脂，分子量為318.364g/mol，其結(jié)構(gòu)如圖1-1所示(Zinedine et al, 2007; Dellafiora et al, 2017)。ZEA是一種弱極性低分子量化合物，呈白色晶體形式。在長激發(fā)波長（360 nm）處呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光，在短波長輻射（260 nm）下呈現(xiàn)更強(qiáng)烈的綠色熒光。對(duì)紫外線輻射的最大吸收出現(xiàn)在236nm，274nm 和 316nm。在照射314nm紫外光輻射并在450nm紫外光輻射后，乙醇中的ZEA發(fā)生最大熒光。ZEA在水中的溶解度為0.002g / 100ml， 熔點(diǎn)為164-165℃。它在儲(chǔ)存期間表現(xiàn)出穩(wěn)定性，并且在暴露于高溫時(shí)不會(huì)降解，也不會(huì)被巴氏殺菌過程破壞。然而，它在紫外線輻射和堿性環(huán)境的影響下會(huì)被降解(Kowalska et al

2.3 結(jié)果分析2.3.1 ZEA對(duì)TM3細(xì)胞相對(duì)成活率的檢測結(jié)果如圖2-1所示，玉米赤霉烯酮對(duì)細(xì)胞染毒處理24h后，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，且隨著玉米赤霉烯酮濃度的增加，TM3細(xì)胞的相對(duì)成活率逐漸降低，與空白組相比，在濃度為30μmol/L時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成活率極顯著降低（P<0.01），通過Graphpad prism分析玉米赤霉烯酮對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50為53.33μmol/L。圖 2-1 玉米赤霉烯酮對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞相對(duì)存活率的影響。圖中“**”，“*”

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本文編號(hào)：2732281