【摘要】：外泌體(exosome,Exo)是一類(lèi)由細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放到胞外的小囊泡,直徑大小約在30-150 nm。它憑借自身能在細(xì)胞間傳遞蛋白,核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA),脂類(lèi)等生物活性物質(zhì)而在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來(lái),已有相當(dāng)多關(guān)于外泌體與病毒感染的研究報(bào)道,尤其是外泌體在人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)和丙型肝炎病毒(the Hepatitis C virus,HCV)感染中生物功能的研究。然而,目前仍未有關(guān)于外泌體在新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染中的相關(guān)報(bào)道。MicroRNA(miRNA),作為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)家族成員之一,通過(guò)mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因,參與多個(gè)生理和病理過(guò)程。在病毒感染中,已發(fā)現(xiàn)多種microRNA也能調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制,然而與NDV感染相關(guān)的microRNA仍鮮有報(bào)道。得到高質(zhì)量的外泌體樣品是外泌體與NDV感染研究進(jìn)行的第一步。為此,我們利用差速離心法分離,并通過(guò)透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy,TEM),納米顆粒捕捉技術(shù)(Nanosight Tracking Analysis,NTA),蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)等不同方法鑒定出可靠有效的HeLa細(xì)胞分泌的外泌體,同時(shí)發(fā)現(xiàn)將NDV感染的HeLa細(xì)胞外泌體純化后孵育DF-1細(xì)胞,與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出明顯細(xì)胞病變,暗示該外泌體能增強(qiáng)NDV感染HeLa細(xì)胞。采用Microarray芯片技術(shù)檢測(cè)新城疫感染組與未感染組的HeLa細(xì)胞外泌體內(nèi)miRNA表達(dá)譜差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)236個(gè)宿主miRNA發(fā)生了兩倍以上的表達(dá)差異,其中145個(gè)miRNA呈現(xiàn)顯著上調(diào)。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測(cè)篩選出25個(gè)可能靶向β干擾素(interferon-β,IFN-β)分子的miRNA,后經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)當(dāng)用poly(I:C)處理或NDV感染HeLa細(xì)胞,分別過(guò)表達(dá)這25個(gè)miRNA,過(guò)表達(dá)其中3個(gè)miRNA(miR-1273f,miR-1184,miR-198)時(shí),IFN-βmRNA和蛋白水平都呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)miRNA mimics與含IFN-β3’UTR熒光載體共轉(zhuǎn)染H293T細(xì)胞時(shí),熒光強(qiáng)度顯著下降,暗示這三個(gè)miRNA可能直接靶向IFN-β3’UTR。后期發(fā)現(xiàn)這三個(gè)miRNA不僅能影響干擾素刺激基因(IFN stimulated genes,ISGs)的轉(zhuǎn)錄如干擾素刺激基因15(Interferon-stimulated gene 15,ISG15),干擾素刺激基因56(Interferon-stimulated gene 56,ISG56),抗粘病毒抗性蛋白(antiviral myxovirus resistance protein 1,Mx1),寡腺苷酸合成酶1(the oligoadenylate synthetase 1,OAS1),還能增強(qiáng)NDV NP mRNA轉(zhuǎn)錄與NP蛋白翻譯,此外模擬外泌體攜帶這些miRNA的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),攜帶有miRNA的外泌體在NDV感染中能增強(qiáng)噬斑在DF-1細(xì)胞上形成,暗示其能促進(jìn)NDV擴(kuò)散。綜上,我們以NDV感染HeLa細(xì)胞,經(jīng)系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三個(gè)通過(guò)直接靶向IFN-β影響NDV復(fù)制的miRNAs(miR-1273f,miR-1184,miR-198),我們首次驗(yàn)證了外泌體能促進(jìn)NDV感染HeLa細(xì)胞,并通過(guò)攜帶宿主miRNA作用于鄰近細(xì)胞,提高鄰近細(xì)胞對(duì)NDV的易感性,從而實(shí)現(xiàn)促病毒感染,說(shuō)明攜帶有利于病毒復(fù)制的miRNA的外泌體可能是促進(jìn)NDV感染的新途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

學(xué)位論文 第二章 NDV 感染 H HeLa 細(xì)胞來(lái)源的外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)精細(xì)，只能通過(guò)電鏡觀察。因此我們分別從感染 ND了外泌體囊泡，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，感染 NDV一些直徑大小約在 100 nm 的顆粒，這與正好處于外泌體結(jié)構(gòu)，且外膜具有明顯的月牙形態(tài)，與外泌體經(jīng)典“茶杯，這兩種狀態(tài)中的外泌體顆粒形態(tài)上差異不明顯，但肉可能較未被感染的 HeLa 細(xì)胞分泌數(shù)量更多的外泌體，

圖 2 外泌體表面標(biāo)志蛋白 CD63 的鑒定Figure 2. Identification of exosomal surface marker protein CD632.3.3 NTA 檢測(cè) HeLa 細(xì)胞來(lái)源的外泌體大小與分布用納米顆粒跟蹤分析儀 zetaview PMX 110 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，未感染病毒的 HeLa 細(xì)胞外泌體樣品中顆粒平均大小為 127.9 nm，其中 125.9 nm 大小的顆粒占該樣品的 99.3%，感染 NDV 的 HeLa 細(xì)胞外泌體樣品中顆粒平均大小為 129.2 nm，其中 125.9 nm 大小的顆粒也占樣品的 99.3%（如圖 3所示）。這些結(jié)果與電鏡觀察到的顆粒大小相吻合，這進(jìn)一步證明了所提樣品為外泌體。同時(shí)，NTA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)未感染病毒與感染 NDV 的 HeLa 細(xì)胞外泌體樣品中顆粒濃度分別為 1.0E+11particles/mL 和 2.5E+11 particles/mL（如圖 3 所示），后者濃度約為前者的 4 倍，這可能是由于 NDV感染增強(qiáng)了 HeLa 細(xì)胞分泌外泌體的能力。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李莫;肺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體中microRNA差異性分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2732090