【摘要】：[目的]近年來對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失的原因之一就是子宮內膜炎,其多見于產(chǎn)后,且多為隱性。研究者們一直在鉆研更安全更高效的治療方法。益生菌的應用是最近幾年的熱點話題,它的好處是無毒安全,在對動物后不會產(chǎn)生藥物殘留,當動物沒有疾病時還可以起到加強動物機體的免疫力,起到預防疾病的作用。本試驗旨在于通過對炎性因子以及炎性通路關鍵基因的測定來研究發(fā)酵乳桿菌對LPS誘導的牛子宮內膜細胞的調節(jié)作用,為發(fā)酵乳桿菌的臨床應用提供依據(jù)。[方法]在實驗室穩(wěn)定傳代培養(yǎng)牛子宮內膜細胞,通過CCK-8的方法確定LPS(脂多糖lipopolysaccharide)作用于細胞的最適濃度和時間;通過16SrDNA序列分析及同源性比較,鑒定購買菌種的準確性,用CCK-8法發(fā)酵乳桿菌與LPS共同作用細胞的最適濃度;利用ELISA法測定IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α的含量,確定炎性因子分泌量的變化;采用實時熒光定量PCR檢測IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α炎性因子和TLR4、NF-κB(P65)、MyD88炎性通路基因的表達量。[結果]采用CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn):LPS在較短的作用時間內沒有表現(xiàn)出毒性作用,相反低濃度刺激會起到輕微的促進細胞生長作用,但較長時間會對牛子宮內膜細胞產(chǎn)生炎性損傷作用,當作用時間為24h、濃度為80μg/mL時,與對照組相比,牛子宮內膜細胞的相對存活率顯著降低(p0.05),當濃度大于80μg/mL時,與對照組相比,牛子宮內膜細胞的相對存活率降低的更為顯著(p0.01),當作用時間為48h,LPS發(fā)揮了強效的毒性作用,與對照組相比,牛子宮內膜細胞的相對存活率極顯著降低(p0.01);LPS與發(fā)酵乳桿菌聯(lián)合作用于牛子宮內膜細胞,短時間內發(fā)酵乳桿菌可緩解LPS引起的細胞毒性作用,作用時間為2h、濃度為10~8CFU/mL時,與對照組相比,牛子宮內膜細胞的相對存活率顯著升高(p0.05),但發(fā)酵乳桿菌長時間刺激作用也會起到毒性作用;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測發(fā)現(xiàn):與對照組相比,LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8四種炎性細胞因子的分泌量極顯著升高(p0.01);與LTA組相比,LPS+LF組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α四種炎性細胞因子的分泌量顯著降低(p0.05);與對照組相比,LF(發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum)組可不同程度地提高四種炎性細胞因子的分泌量(p0.05,p0.05),但相比于LPS組的升高,LF組屬于正常的應激反應。由此表明,發(fā)酵乳桿菌可緩解由LPS誘導產(chǎn)生的牛子宮內膜細胞炎性細胞因子的過度分泌;采用實時熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn):與對照組相比,LPS組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB(p65)基因mRNA的相對表達量極顯著升高(p0.01);與LPS組相比,LPS+LF組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-κB(p65)基因mRNA的相對表達量極顯著降低(p0.01);與對照組相比,LF組7種基因mRNA的表達量有不同程度的升高(p0.05,p0.05,p0.01),但均低于LPS組,在正常應激反應范圍內。由此表明,發(fā)酵乳桿菌可極顯著降低由LPS誘導造成的炎性相關基因mRNA的高表達。[結論]1、80μg/mL的LPS孵育細胞24h,可以建立良好的子宮內膜細胞炎癥損傷模型;2、發(fā)酵乳桿菌能降低炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的含量,同時可以降低TLR4、NF-κB、MyD88炎性通路基因以及IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎性因子的基因表達,說明此發(fā)酵乳桿菌對于LPS誘導的牛子宮內膜細胞的炎癥模型有調節(jié)作用,為臨床應用提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23
【圖文】：

圖 1 LPS 對子宮內膜細胞相對存活率的檢測結果（6h）ults of LPS on the survival effiency of endometrial epithelial cells（注：數(shù)據(jù)標簽中，“**”、“*”分別代表與空白組相比，差異極顯著和差異顯著。（下同）mpared with control group，“**”、“*” respective represented significant difference and difference, the sam圖 2 LPS 對子宮內膜細胞相對存活率的檢測結果（12h）

圖 1 LPS 對子宮內膜細胞相對存活率的檢測結果（6h）ults of LPS on the survival effiency of endometrial epithelial cells（注：數(shù)據(jù)標簽中，“**”、“*”分別代表與空白組相比，差異極顯著和差異顯著。（下同）mpared with control group，“**”、“*” respective represented significant difference and difference, the sam

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本文編號：2731167