【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種危害動(dòng)物繁殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病。偽狂犬病病毒可感染多種哺乳動(dòng)物,如豬、鼠、貉、水貂和狐等。2011年,我國多個(gè)省份的生豬養(yǎng)殖場暴發(fā)了PRV疫情,且此次流行的毒株導(dǎo)致Bartha疫苗株難以對豬群提供全面保護(hù)。該毒株不僅使豬群發(fā)病,還導(dǎo)致狐等毛皮動(dòng)物發(fā)病。當(dāng)狐感染PRV后,表現(xiàn)出神經(jīng)性瘙癢、呼吸困難、精神狂躁或沉郁等臨床癥狀,體溫變化多表現(xiàn)為“回歸熱”,發(fā)病的狐多以死亡為轉(zhuǎn)歸,給養(yǎng)狐業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為更好的防控該病,通過對狐PRV的分離鑒定,以gB蛋白的原核表達(dá)和HRP酶標(biāo)二抗的制備為基礎(chǔ),建立狐PRV間接ELISA檢測方法,用于狐PRV抗體的檢測。采集2017~2018年間送檢的疑似感染PRV的病死狐的腦組織樣品30份,經(jīng)PCR鑒定其中6份樣品為PR陽性,陽性率為20%。將陽性的病料進(jìn)行病毒分離,通過PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)對分離的病毒進(jìn)行驗(yàn)證,超速離心純化后經(jīng)透射電鏡觀察該病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu),證實(shí)分離株為PRV,命名為HBfox-25。測得病毒的TCID_(50)為10~(-5.6)/0.1 mL,經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn),狐出現(xiàn)神經(jīng)異常、皮膚瘙癢并撕咬接種部位等癥狀,5d后死亡。本研究通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出HBfox-25的gB基因,并將目的片段與表達(dá)載體pET-32a連接,得到重組質(zhì)粒pET-32a-gB。再將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,37℃震蕩培養(yǎng),待菌液生長至對數(shù)期時(shí)用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。最后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測得純化后的蛋白濃度為1 mg/mL。通過棋盤滴定法來確定抗原最佳包被濃度。通過飽和硫酸銨法粗提狐血清中的IgG,過柱純化。將純化后的IgG免疫兔獲得兔抗狐抗體,通過改良的二步法將純化后的抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記。從而建立狐PRV間接ELISA檢測方法。經(jīng)驗(yàn)證,本研究建立的狐PRV間接ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。該方法的建立為狐PR的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)支持。
【學(xué)位授予單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.92
【圖文】：

圖 1-1 PRV 病毒粒子結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Structure of PRV virion1.3.2 偽狂犬病病毒的理化特性偽狂犬病病毒又稱皰疹病毒I型，在所有的皰疹病毒中其抗逆性最強(qiáng)。在外界環(huán)境中的存活時(shí)間的長短主要受環(huán)境的溫度和pH值的影響。該病毒耐熱性強(qiáng)45～55℃下30～50 min才能使其失去感染力，80℃ 3 min的條件下也能對該病毒進(jìn)行滅活；pH在4～9之間較穩(wěn)定，在過酸或過堿的環(huán)境下病毒能很快失活[23]。在0～6℃的條件下，將病料用50%的甘油鹽水浸泡154 d，只能減弱該病毒的感染力，當(dāng)保存到3年的時(shí)候仍然對動(dòng)物具有感染力；病毒在腐爛的病料中抵抗力略差，約保存11d左右就失去了感染能力。偽狂犬病病毒對福爾馬林和紫外線照射敏感，病毒在距離為27 cm時(shí)15 W紫外滅菌燈可以使病毒失活。偽狂犬病病毒對酶類也比較敏感，胰蛋白酶能滅活偽狂犬病毒[24]。采用濃度為 0.5%～1%的氫氧化鈉能迅速滅活偽狂犬病病毒；將病毒培養(yǎng)物真空冷凍干燥后在-70℃條件下可以保存許多年[25]。通過試驗(yàn)表明，往病毒懸浮液里面加入適量的蔗糖、左

置于 1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。對電泳結(jié)果進(jìn)行記錄和拍照。出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果相一致的大小約為 286 bp 的目的條帶（圖 2-1），證明該動(dòng)物 PRV 的感染。圖2-1 樣品檢測結(jié)果Fig. 2-1 Sample test ResultsM:DL2000 Marker; 1:陽性對照;2:陰性對照;檢測樣品:3、4、5、6、7、8；M:DL2000 Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; Test samples:3、4、5、6、7、8;2.3.2 病毒的分離與傳代取凍于-80℃破碎組織上清解凍后經(jīng) 0.22 μm 濾器過濾，取 400 μL 接種至鋪至細(xì)胞瓶底部 90％的 MDCK 細(xì)胞中感作，1 h 后換細(xì)胞維持液，48 h 后反復(fù)凍融三次收毒，再進(jìn)行盲傳。當(dāng)盲傳至第四代，培養(yǎng) 24 h 后，MDCK 細(xì)胞出現(xiàn) CPE。具體表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)膨脹、折光度增加、形成合胞體且具有樹突狀突出、形成拉網(wǎng)狀最終細(xì)胞脫落的現(xiàn)象。這些病變特征屬于偽狂犬病病毒感染細(xì)胞后的標(biāo)志性特征(圖 2-2)。

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本文編號：2730609