【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬輪狀病毒A型(Group A rota virus,GAR)以及豬delta冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原,這四種仔豬腹瀉病在臨床表現(xiàn)非常相似,難以鑒別診斷。本研究針對PEDV、TGEV、GAR以及PDCoV四種腹瀉病毒,將酶促反應(yīng)顯色技術(shù)、不對稱PCR單鏈擴(kuò)增技術(shù)和基因芯片技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建一套PEDV-TGEV-G AR-PDCoV可視化酶促寡核苷酸共檢基因芯片技術(shù),進(jìn)行了初步臨床應(yīng)用評價研究。研究結(jié)果結(jié)果顯示,各目的基因的不對稱PCR上下游引物最佳濃度比分別為:PEDV-S:1:20;PEDV-M:1:10;TGEV-S:1:20;TGEV-N:1:20;GAR-VP7:1:10;GAR-NSP4:1:10;PDCoV-M:1:10;PDCoV-N:1:20,此時目的片段的單鏈產(chǎn)物量最多。確定了芯片檢測的操作程序為:在50℃環(huán)境中雜交90 min后,進(jìn)行洗滌。與2000倍稀釋的鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶酶聯(lián)后用DAB顯色液顯色后進(jìn)行結(jié)果判讀。本研究根據(jù)陽性對照生成棕褐色斑點,空白對照無斑點生成,確定了芯片檢測質(zhì)量與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。該可視化共檢芯片特異性好,PEDV、TGEV、GAR以及P DCoV的單獨檢測及混合檢測雜交結(jié)果均呈陽性,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV及FMDV雜交結(jié)果呈陰性,探針之間沒有相互干擾;各探針基因的靈敏性均可達(dá)10p g/μl(2.83×10~6copies/μl);芯片在保存180天后仍可進(jìn)行有效檢測。研究應(yīng)用所構(gòu)建的芯片對四川、重慶地區(qū)的200份臨床送檢樣本進(jìn)行了檢測。本研究成功構(gòu)建了一套能高通量檢測四種仔豬腹瀉疾病的酶促可視化基因芯片,該方法特異性強(qiáng),靈敏度高,為臨床鑒別仔豬腹瀉類疾病提供了一種新的方法。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 1 酶促可視化寡核苷酸基因芯片技術(shù)路線圖FIG. 1 The technology roadmap for the visualization of oligonucleotide gene chips.

圖 1 酶促可視化寡核苷酸基因芯片技術(shù)路線圖FIG. 1 The technology roadmap for the visualization of oligonucleotide gene chips.

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本文編號：2729735