【摘要】：熱應(yīng)激是當(dāng)前危害奶業(yè)生產(chǎn)的重要因素,有研究認(rèn)為腸道上皮的損傷是導(dǎo)致熱應(yīng)激致奶牛大幅減產(chǎn)的核心問題,保護(hù)腸道上皮免受損傷可能是應(yīng)對熱應(yīng)激的有效方法。谷氨酸(Glutamic acid,Glu)是奶牛腸道所需能量的主要來源,在腸道健康等方面起重要作用。因此,本試驗以Glu對體外培養(yǎng)的熱損傷奶牛小腸上皮細(xì)胞(Intestine epithelium cell,IEC)的修復(fù)機(jī)制為研究主題,初步探索Glu在奶牛小腸熱損傷修復(fù)中的作用機(jī)理,為奶牛業(yè)熱應(yīng)激問題找到有效解決途徑。試驗一:奶牛小腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法研究分別采用灌腸消化法、機(jī)械刮取+酶解法(先使用膠原酶Ⅺ消化30min,再使用胰蛋白酶消化)對小腸上皮組織進(jìn)行分離。結(jié)果顯示:通過機(jī)械刮取+酶解法獲得的IEC數(shù)量多且細(xì)胞活性較高;分別采用差速貼壁法,差速消化法、細(xì)胞刮除法,進(jìn)而對IEC進(jìn)行純化,而后采用CCK-8法測定IEC的生長曲線,并使用HE染色的方法對IEC進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:使用差速貼壁法純化后,IEC純度相對較高,相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):IEC在培養(yǎng)瓶底部呈現(xiàn)上皮細(xì)胞特有的“鋪路石狀”,測定的生長曲線呈“S”型,可用于后續(xù)試驗。試驗二:奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型的建立將生長狀態(tài)良好的奶牛IEC分別置于對照組(37℃)、熱處理組(40℃、42℃)下處理0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h。然后分別測定各組上清液中的谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenas,LDH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及奶牛IEC中熱休克蛋白、細(xì)胞間連接蛋白、炎癥因子、細(xì)胞凋亡蛋白等相應(yīng)基因的mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示:IEC處于熱環(huán)境下,GSH-PX、SOD水平下降,LDH、MDA水平升高,細(xì)胞熱休克蛋白27(Heat Shock Proteins 27,HSP27),熱休克蛋白70(Heat Shock Proteins 70,HSP70),熱休克蛋白90(Heat Shock Proteins 90,HSP90)基因mRNA相對表達(dá)量在42℃6 h條件下顯著高于其他處理組(P0.05),熱處理組occludin的mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組(P0.05),42℃下處理6 h時抗炎因子白細(xì)胞介素10(Interleukin-10,IL-10)基因mRNA相對表達(dá)量對低,B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)與Bax的比值在40℃、42℃1 h、4 h時最高,4 h之后一直降低,8 h降至最低。因此,在42℃條件下處理細(xì)胞6 h時即產(chǎn)生較明顯損傷效果,成功建立熱損傷模型。試驗三:谷氨酸對熱損傷奶牛小腸上皮細(xì)胞的影響將上皮細(xì)胞置于42℃培養(yǎng)6 h后,在含不同濃度Glu的培養(yǎng)基(Glu濃度分別為4、8、12、16、20、28、36 mmol/L)中培養(yǎng)12 h后,收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞。檢測上清液中的抗氧化指標(biāo)水平以及奶牛IEC中熱休克蛋白、細(xì)胞間連接蛋白、炎癥因子、細(xì)胞凋亡蛋白等相關(guān)基因的mRNA的相對表達(dá)量,研究不同濃度Glu對熱損傷細(xì)胞的修復(fù)作用。結(jié)果顯示:Glu濃度為8mmol/L時OD值最高;Glu濃度為8,12,16,20,28,36 mmol/L時,GSH-PX和SOD含量升高,LDH含量在Glu濃度為28mmol/L時候最低,MDA含量在Glu濃度為20mmol/L時最低;Glu濃度為36mmol/L時HSP27,HSP70,HSP90達(dá)到最高;當(dāng)Glu濃度4mmol/L時,claudin-1基因mRNA相對表達(dá)量最低,當(dāng)Glu濃度為8 mmol/L時,occludin基因mRNA相對表達(dá)量達(dá)到最高;低濃度組促炎因子IL-1β基因mRNA的相對表達(dá)量低于熱損傷組,抗炎因子IL-10基因mRNA的相對表達(dá)量在Glu濃度為28mmol/L時高于熱損傷組;Bcl-2和Bax的mRNA相對表達(dá)量均在低Glu濃度時低于熱損傷組,但是,Bcl-2/Bax的值在Glu濃度為4、16、36 mmol/L高于熱損傷組。由此可知,Glu對熱損傷6 h的IEC具有一定的修復(fù)作用,其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)IEC抗氧化能力,對與熱休克蛋白相關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)節(jié),并促進(jìn)了與緊密連接連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá),減弱了促炎因子的表達(dá),增強(qiáng)抗炎因子的表達(dá),進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞活力。結(jié)論:通過采用機(jī)械刮取+酶解法分離細(xì)胞和差速貼壁法對分離的細(xì)胞進(jìn)行純化后,成功獲得了純度較高,活力較好、增殖能力強(qiáng)的奶牛IEC。將奶牛IEC置于42℃下處理6 h時,成功建立熱應(yīng)激模型。不同濃度的Glu添加對熱損傷奶牛IEC起了到修復(fù)作用。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23
【圖文】：

培養(yǎng)瓶上清液中死細(xì)胞較多；灌腸消化法分離，死細(xì)胞相對較少（如圖2-1）。培養(yǎng) 6 d 后發(fā)現(xiàn)，機(jī)械刮取+酶解法細(xì)胞遷移較多，活性較高，增值能力較強(qiáng)；灌腸消化法細(xì)胞增殖能力較弱，細(xì)胞數(shù)量較少（如圖 2-2）。灌腸消化法獲得的細(xì)胞培養(yǎng) 10 d 時，細(xì)胞無法連接成片逐漸凋亡；而機(jī)械刮取+酶解法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)到第 10 d 時，細(xì)胞在瓶底分布均勻，連接成片（如圖 2-3）。圖 2-1 使用灌腸消化法（左圖）和機(jī)械刮取+酶解法（右圖）分離后培養(yǎng)3 d 細(xì)胞（100 ×）Fig. 2-1 Cultivation of cells for 3 d after isolate by clyster digestion (left) andmechanical scraping plus+enzymatic hydrolysis (right) (100 times)圖 2-2 使用灌腸消化法（左圖）和機(jī)械刮取+酶解法（右圖）分離后培養(yǎng)6 d 細(xì)胞（100 ×）Fig. 2-2 Cultivation of cells for 3 d after isolate by clyster

強(qiáng)；灌腸消化法細(xì)胞增殖能力較弱，細(xì)胞數(shù)量較少（如圖 2-2）。灌腸消化得的細(xì)胞培養(yǎng) 10 d 時，細(xì)胞無法連接成片逐漸凋亡；而機(jī)械刮取+酶解法獲細(xì)胞培養(yǎng)到第 10 d 時，細(xì)胞在瓶底分布均勻，連接成片（如圖 2-3）。圖 2-1 使用灌腸消化法（左圖）和機(jī)械刮取+酶解法（右圖）分離后培養(yǎng)3 d 細(xì)胞（100 ×）Fig. 2-1 Cultivation of cells for 3 d after isolate by clyster digestion (left) andmechanical scraping plus+enzymatic hydrolysis (right) (100 times)

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