發(fā)布時(shí)間：2020-06-26 00:12

【摘要】：新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）也被稱為禽副黏病毒1型（avianparamyxovirus serotype-1，APMV-1)，廣泛分布于世界各地，嚴(yán)重危害全球家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。NDV只有單一血清型，但存在多種基因型，當(dāng)前NDV在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)以class II中基因VII型為主，其他基因型散發(fā)的流行態(tài)勢(shì)。然而在NDV的免疫預(yù)防上，半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)國(guó)內(nèi)外一直沿用經(jīng)典基因II型弱毒疫苗株，由于基因型與抗原性的不匹配，當(dāng)前廣泛應(yīng)用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感染，并且受到強(qiáng)毒攻擊后排毒現(xiàn)象嚴(yán)重，即使在免疫家禽群體中依然有強(qiáng)毒株不斷被分離的報(bào)道。反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，尤其是理想的病毒拯救系統(tǒng)，為深入研究NDV結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、致病機(jī)制提供了有力工具，為研發(fā)與流行毒株相一致的基因VII型NDV弱毒疫苗候選株及候選疫苗載體提供了新的思路。 本研究以鵝源基因VII型NDV NA-1株為研究對(duì)象，建立以CMV為啟動(dòng)子利用真核細(xì)胞廣泛存在的RNA聚合酶Ⅱ的反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)不依賴傳統(tǒng)T7RNA聚合酶，操作簡(jiǎn)便高效。在此基礎(chǔ)上，將NDV NA-1株F蛋白裂解序列從強(qiáng)毒株特征基序突變?yōu)槿醵咎卣骰�，從而獲得基因VII型NDV致弱疫苗候選株及候選載體rmNA-1。為探索重組NDV表達(dá)兩個(gè)甚至多個(gè)外源蛋白的可能性，本研究以紅色熒光蛋白基因和綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)雙外源基因重組新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，結(jié)果表明以NDV為載體具有構(gòu)建重組多聯(lián)、多價(jià)疫苗或開(kāi)發(fā)可攜帶多種免疫分子的腫瘤治療載體的潛力；以此鵝源NDV致弱株為活病毒載體，構(gòu)建表達(dá)鵝細(xì)小病毒VP3保護(hù)性抗原蛋白重組新城疫病毒rmNA-VP3，并對(duì)其生物學(xué)特性及雛鵝免疫特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，主要內(nèi)容如下： I．基于CMV啟動(dòng)子NDV NA-1株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的鵝源基因VII型NDV NA-1株基因組序列，將全基因組分為7個(gè)末端部分重疊的基因片段進(jìn)行分段克隆，利用鄰近片段重疊部分的限制性酶切位點(diǎn)通過(guò)體外拼接組裝成完整基因組cDNA，并分別在5’端和3’端引入錘頭狀核酶（HamRz）序列和丁型肝炎病毒核酶（HdvRz）序列，以產(chǎn)生精確的病毒基因3’末端和5’末端，克隆于真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo中CMV啟動(dòng)子的下游，構(gòu)成NDV NA-1全基因組cDNA克隆pCI-NA-1。同時(shí)分別將NP、P和L基因ORF，克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1中CMV啟動(dòng)子的下游，構(gòu)成三個(gè)輔助質(zhì)粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。共轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)質(zhì)粒pCI-NA-1與三個(gè)輔助質(zhì)粒于BHK-21細(xì)胞拯救獲得具有感染性的子代病毒。同時(shí)以eGFP為報(bào)告基因，構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白重組新城疫病毒，為今后制備新型基因VII型新城疫病毒活載體研發(fā)雙價(jià)或多價(jià)疫苗奠定了基礎(chǔ)。 II．鵝源基因VII型新城疫病毒NA-1致弱株的構(gòu)建 為構(gòu)建與當(dāng)前流行毒株基因型抗原性相匹配的基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候選株及疫苗載體，在已建立的NDV NA-1株簡(jiǎn)便高效的反向遺傳操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上，將NDV NA-1株天然典型強(qiáng)毒株特征的F蛋白裂解位點(diǎn)112RRQKR↓F117替換為弱毒疫苗株LaSota F裂解位點(diǎn)相應(yīng)基序112GRQGR↓L117，拯救獲得突變修飾株rmNA-1，致病性分析結(jié)果顯示突變株rmNA-1致病力顯著降低，致病類(lèi)型從強(qiáng)毒株變?yōu)槿醵局�，成功�?shí)現(xiàn)對(duì)病毒的致弱，而且突變致弱株rmNA-1具有和親本株rNA-1相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，并且連續(xù)傳代10次，突變堿基仍然具有穩(wěn)定性，不發(fā)生回復(fù)突變或其他突變，為制備新型基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候選株及候選載體奠定了基礎(chǔ)。 III.表達(dá)雙熒光蛋白重組新城疫病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性評(píng)價(jià) 為探索重組NDV表達(dá)兩個(gè)外源保護(hù)性抗原蛋白構(gòu)建重組多聯(lián)或多價(jià)疫苗或研制可攜帶多種免疫分子的腫瘤靶向性治療制劑的可能性，本研究以綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白mCherry為外源蛋白，將兩者編碼序列以內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）相連構(gòu)成單獨(dú)轉(zhuǎn)錄單位，插入到新城疫病毒基因組中，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)雙熒光蛋白重組新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，紅色熒光蛋白mCherry和綠色熒光蛋白GFP在重組病毒感染細(xì)胞同時(shí)獲得了正確表達(dá)，且不影響病毒其他蛋白的表達(dá)。表達(dá)雙熒光蛋白重組病毒rmNA-mCh-GFP具有與母本株rmNA-1相似的體外生長(zhǎng)曲線，盡管在最高生長(zhǎng)滴度上與母本株相差約25倍，但rmNA-mCh-GFP仍具有較高的生長(zhǎng)滴度。表明重組NDV具有同時(shí)表達(dá)兩個(gè)甚至多個(gè)外源蛋白的潛力。 VI.表達(dá)GPV VP3蛋白重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫原性分析 克隆鵝細(xì)小病毒VP3基因ORF構(gòu)成完整NDV基因表達(dá)盒，插入上述NDV突變致弱株rmNA-1基因組P和M之間，構(gòu)成表達(dá)鵝細(xì)小病毒VP3蛋白重組新城疫病毒rmNA-VP3。通過(guò)免疫熒光染色、Western blot檢測(cè)證實(shí)外源蛋白VP3可獲得正確有效的表達(dá)，與母本株rmNA-1相比，rmNA-VP3擁有更低的致病力，并保持母本株良好的遺傳穩(wěn)定性，將rmNA-VP3分別在雞胚中連續(xù)傳代10次，外源基因VP3穩(wěn)定遺傳且F裂解位點(diǎn)修飾堿基仍然具有穩(wěn)定性，不發(fā)生回復(fù)突變或其他突變。在雞胚生長(zhǎng)特性上，重組病毒rmNA-VP3具有與rmNA-1及野生型rNA-1相似的生長(zhǎng)趨勢(shì)，但由于外源基因的插入病毒滴度達(dá)到高峰的時(shí)間略晚，滴度峰值低于母本毒約20倍左右，以此表達(dá)鵝細(xì)小病毒VP3蛋白重組新城疫病毒免疫雛鵝顯示出良好的免疫原性，整個(gè)免疫觀察期無(wú)疫苗相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)，且可同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的鵝細(xì)小病毒和新城疫病毒中和抗體，表明重組病毒rmNA-VP3具有免疫預(yù)防鵝細(xì)小病毒和新城疫病毒感染的潛力，同時(shí)，rmNA-1可作為病毒活載體表達(dá)外源蛋白而不影響其本身免疫原性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

疫病毒分子生物學(xué)疫病毒分類(lèi)地位與形態(tài)特征病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）因首次分離于英格子呈多形性，一般近似球形，有時(shí)也可呈長(zhǎng)絲狀，成熟的-250nm，外披有來(lái)自宿主細(xì)胞膜的磷脂雙分子層的囊膜，由血凝素神經(jīng)氨酸酶（Haemagglution-Neuraminidase，HN protein，F(xiàn)）構(gòu)成的兩種大小不同的纖突，內(nèi)面附有一層蛋白（Matrix protein，M），病毒粒子的內(nèi)部為核衣殼蛋sphoprotein，P）、大分子蛋白（Large protein，L）和單鏈對(duì)稱的核衣殼，病毒粒子的結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖 1。

第一篇 文獻(xiàn)綜述 第 2 章 新城疫病毒反向遺傳學(xué)研究進(jìn)展必須的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白的編碼序列的輔助質(zhì)粒即表達(dá) NP L 三種結(jié)構(gòu)蛋白的真核質(zhì)粒，用以裝配病毒的核衣殼。包含病毒反基因組的殼一方面作為模板合成病毒的 RNA，另一方面轉(zhuǎn)錄翻譯出各結(jié)構(gòu)蛋白，配出子代病毒顆粒。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Edith Renaud-Gabardos;Fransky Hantelys;Florent Morfoisse;Xavier Chaufour;Barbara Garmy-Susini;Anne-Catherine Prats;;Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy[J];World Journal of Experimental Medicine;2015年01期

2 田麗紅,賈永清,王君偉,李一經(jīng),趙麗榮,Ulrich Neu mann;鵝細(xì)小病毒VP3基因重組禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2002年09期

3 趙麗榮,王君偉,賈永清;鵝細(xì)小病毒VP3基因重組禽痘病毒的構(gòu)建和表達(dá)[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2003年06期

本文編號(hào)：2729534