【摘要】：犬乳腺腫瘤是母犬最常見的腫瘤之一,犬作為伴侶動物,在生活環(huán)境等方面與人類也有很多相似之處,故犬自發(fā)性乳腺腫瘤是人乳腺腫瘤的良好模型。SOX2在多種腫瘤中有較高表達(dá),是腫瘤的研究熱點(diǎn),但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制尚未完全明確。故本試驗以分別從犬乳腺腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中分離培養(yǎng)的CHMp和CHMm細(xì)胞系為研究對象,探究SOX2對犬乳腺腫瘤不同細(xì)胞系增殖和遷移的作用機(jī)制。本試驗將SOX2基因的siRNA以脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp和CHMm中,并檢驗SOX2的敲低效果。通過CCK-8和克隆形成試驗檢測各組細(xì)胞系的增殖率。劃痕愈合試驗和Transwell小室遷移試驗來檢測敲低SOX2后犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp、CHMm的遷移能力。Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。測定他莫昔芬和順鉑對各組細(xì)胞的IC_(50),檢測SOX2敲低后犬乳腺腫瘤細(xì)胞對他莫昔芬和順鉑的敏感性變化。試驗結(jié)果:1、為檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞SOX2的敲低效果,對各組細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行SOX2蛋白表達(dá)量的檢測,轉(zhuǎn)染3種針對SOX2基因不同位點(diǎn)的siRNA對SOX2的表達(dá)進(jìn)行干擾后,SOX2在蛋白水平的表達(dá)量下降,與對照組相比差異極顯著(P0.001)。2、CCK-8和克隆形成試驗檢測細(xì)胞增殖能力,與對照組相比,SOX2敲低的CHMp、CHMm細(xì)胞的增殖率和克隆形成率均顯著下降(P0.001)。3、劃痕愈合試驗和Transwell小室遷移試驗檢測細(xì)胞遷移能力,SOX2敲低的CHMp、CHMm細(xì)胞劃痕愈合率和穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P0.001)。4、SOX2敲低可以抑制Wnt/β-catenin信號通路,SOX2敲低的CHMp、CHMm細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比β-catenin蛋白表達(dá)量明顯降低,顯著性差異(P0.001)。5、SOX2可以抑制Hippo信號通路,SOX2敲低的CHMp、CHMm細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比NF2蛋白表達(dá)量明顯升高,YAP蛋白表達(dá)量明顯降低,顯著性差異(P0.001)。6、SOX2敲低的CHMp、CHMm細(xì)胞EMT標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)量明顯升高,N-cadherin、Vimentin表達(dá)量均明顯降低(P0.001)。7、敲低SOX2后4羥-他莫昔芬和順鉑對犬乳腺腫瘤細(xì)胞IC_(50)顯著降低(P0.05),犬乳腺腫瘤對4羥-他莫昔芬和順鉑的敏感性升高。綜上所述,本試驗成功構(gòu)建了SOX2敲低的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型,敲低SOX2可通過抑制Hippo信號通路降低犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力,提高犬乳腺腫瘤細(xì)胞對他莫昔芬和順鉑的敏感性,進(jìn)一步完善了SOX2調(diào)控乳腺腫瘤的機(jī)制,為以SOX2為乳腺腫瘤治療靶點(diǎn)提供參考。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.292
【圖文】：

結(jié)果.1 犬乳腺腫瘤細(xì)胞 CHMp、CHMm 的 SOX2 敲低效果檢測為探究 SOX2 在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中的作用，用 Lipofectamin 2000 作為轉(zhuǎn)染試劑siRNA 轉(zhuǎn)染至犬乳腺腫瘤細(xì)胞 CHMp、CHMm 內(nèi)對其進(jìn)行 SOX2 敲低。為檢測轉(zhuǎn)染后胞 SOX2 的敲低效果，對各組細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行 SOX2 蛋白表達(dá)量的檢測，試驗結(jié)果如3-1、3-2 所示，轉(zhuǎn)染試劑組、轉(zhuǎn)染無關(guān)基因陰性對照組與空白對照組相比 SOX2 在蛋白平上的表達(dá)量相比均無顯著性差異（P>0.05）；轉(zhuǎn)染 3 種針對 SOX2 基因不同位點(diǎn)的 siR對 SOX2 的表達(dá)進(jìn)行干擾后，SOX2 在蛋白水平的表達(dá)量下降，與對照組相比差異極顯（P<0.001）。表明轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染無關(guān)基因?qū)?CHMp、CHMm 細(xì)胞的 SOX2 蛋白水平的表達(dá)無影響，3 種針對 SOX2 基因不同位點(diǎn)的 siRNA 均可降低 CHMp、CHMm 細(xì)胞SOX2 蛋 白 表 達(dá) 。 以 上 證 明 SOX2 敲 低 的 CHMp-siSOX2-A 、 CHMp-siSOX2-CHMp-siSOX2-C、CHMm-siSOX2-A、CHMm-siSOX2-B、CHMm-siSOX2-C 犬乳腺腫細(xì)胞模型建立成功，后續(xù)試驗選擇 CHMp-siSOX2-A、CHMp-siSOX2-B、CHMm-siSOX2CHMm-siSOX2-B 作為試驗組進(jìn)行試驗。

注：P<0.001，表示差異極顯著，標(biāo)記為***圖 3-2 SOX2 敲低效果分析Fig. 3-2 SOX2 knockdown effect analysis3.2 犬乳腺腫瘤細(xì)胞敲低 SOX2 后對其細(xì)胞增殖能力的影響為探究敲低 SOX2 對犬乳腺腫瘤細(xì)胞 CHMp、CHMm 增殖能力的影響，在敲低 SOX2 后24 h 用 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞的增殖能力，并計算各組細(xì)胞增殖率。試驗結(jié)果如圖 3-3 所示，與對照組相比，CHMp-siSOX2-A、CHMp-siSOX2-B、CHMm-siSOX2-A、CHMm-siSOX2-B細(xì)胞的增殖率均下降，差異極顯著（P<0.001）。表明 SOX2 敲低能夠顯著降低 CHMp、CHMm細(xì)胞的增殖能力。

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