【摘要】：豬偽狂犬病(Porcine Pseudoraibies,PR)又稱Aujeszky病,由偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)引起,PRV屬于皰疹病毒科(Varicello virus)病毒。豬是PRV的天然貯藏宿主,感染豬呈高死亡率、神經(jīng)系統(tǒng)障礙、繁殖障礙與呼吸道疾病等癥狀。2011年,我國(guó)范圍內(nèi)多個(gè)地區(qū)報(bào)道有豬偽狂犬病的爆發(fā),使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)損失巨大。對(duì)于豬偽狂犬病的防控,已成為當(dāng)下養(yǎng)豬業(yè)的重大課題。前期診斷工作在該病的防控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此建立一種新的特異性高與敏感性強(qiáng)的診斷方法,對(duì)于該病的防控至關(guān)重要。gE囊膜糖蛋白在PRV中高度保守,是用做診斷技術(shù)相關(guān)研究工作的理想蛋白。納米抗體(nanobody)分子量小且具有特異性高、親和力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可溶性高、易于進(jìn)入受體間隙識(shí)別特殊抗原表位、可在多系統(tǒng)中表達(dá)、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前納米抗體被廣泛應(yīng)臨床檢測(cè)與診斷中,作為新一代抗體衍生物,納米抗體具有巨大的應(yīng)用前景。本研究利用純化后的gE重組蛋白對(duì)雙峰駝進(jìn)行免疫,構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)。通過噬菌體展示技術(shù),從富集后的文庫(kù)中淘選出了2株針對(duì)gE重組蛋白的特異性納米抗體。為后期建立新型豬偽狂犬疾病診斷方法和篩選具有中和活性的納米抗體,提供必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果如下:1、gE重組蛋白的表達(dá)與純化:實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存的PRV重組質(zhì)粒PET-28a-gE轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Trans5α中,經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)后獲得了28KaD可溶性的gE重組蛋白。經(jīng)鎳柱層析法純化后,獲得較高純度的gE重組蛋白。Western-blot驗(yàn)證目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。2、純化蛋白免疫雙峰駝與噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建將純化后的2mg gE重組蛋白與弗氏佐劑充分乳化后,免疫雙峰駝。6次免疫后,檢測(cè)血清中針對(duì)gE重組蛋白的特異性抗體效價(jià)達(dá)到1:256000。分離血液淋巴細(xì)胞,提取總RNA將其反轉(zhuǎn)錄為CDNA。經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增出VHH基因,擴(kuò)增后基因與pCANTAB 5E載體連接。重組載體利用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞后,獲得VHH噬菌體展示文庫(kù),鑒定其庫(kù)容量為5×10~7。菌液PCR與基因測(cè)序鑒定文庫(kù)的陽性率與多樣性,結(jié)果顯示陽性率為99%,基因序列比對(duì)顯示多樣性良好。3、特異性納米抗體的篩選:以gE重組蛋白作為特異性納米抗體淘選的包被抗原,3輪淘選后,ELISA檢測(cè)特異性噬菌體的富集效果。最終篩選出2株針對(duì)gE重組蛋白的特異性納米抗體。綜上所述,本研究中,利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了1.2 mg/m L可溶性的gE重組蛋白。利用噬菌體展示技術(shù)篩選出了針對(duì)gE重組蛋白的特異性納米抗體,為后期建立豬偽狂犬疾病診斷方法和篩選具有中和活性的納米抗體提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.28
【圖文】：

圖 1-1 PRV 基因組的示意圖，顯示較長(zhǎng)的 UL 獨(dú)特區(qū)域和較短的 US 獨(dú)特區(qū)域，反向重復(fù)序列（IR 和 TR）。（引自（ Fuchs et al.2002））Figure 1-1 Schematic diagram of the PrV genome showing longer UL unique regions and shorter USique regions, inverted repeats (IR and TR). (cited from (Fuchs et al. 2002))表 1-1 PRV 囊膜蛋白各階段作用Table1-1 The roles of PRV envelope protein

圖 1-2 PRV 病毒粒子結(jié)構(gòu)圖 （引自（ Lisa E Pomeran-2 PRV virus particle structure diagram (cited from (Lisa

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本文編號(hào)：2725809