【摘要】：本試驗(yàn)以仔豬不同組織和豬腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2為研究對(duì)象,利用生物信息學(xué)對(duì)豬NLRP9蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及相互作用蛋白進(jìn)行分析預(yù)測(cè);利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡、免疫組化和免疫熒光等試驗(yàn)方法研究NLRP9蛋白在仔豬11種不同組織以及腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2中的表達(dá)與定位;采用RNA干擾與添加脂多糖等試驗(yàn)方法研究NLRP9基因在腸上皮細(xì)胞IPEC-J2中的功能。結(jié)果如下:在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得豬NLRP9基因和蛋白序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,NLRP9基因定位在6號(hào)染色體上,編碼996個(gè)氨基酸,分子量113.8 KDa,理論等電點(diǎn)為5.56,分子式為C5113H8038N1316O1476S703。該蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)域,其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括55.72%的α-螺旋結(jié)構(gòu)、8.94%的β-轉(zhuǎn)角、19.68%的無(wú)規(guī)卷曲和25.66%的延伸鏈。保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镻YRIN、NACHT與LRR,進(jìn)一步分析顯示NRLP9蛋白可能與NLRC4和CSRNP1蛋白存在相互作用關(guān)系。利用RT-PCR、qRT-PCR、免疫印跡、免疫組化和免疫熒光研究了 NLRP9蛋白在仔豬不同組織中的表達(dá)和定位。結(jié)果表明,NLRP9mRNA及其蛋白在選取的11種組織中均有表達(dá),利用免疫組化以及免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步分析NLRP9在豬小腸、卵巢和睪丸中的定位,結(jié)果顯示NLRP9蛋白主要定位在小腸上皮細(xì)胞,卵巢卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞。熒光定量PCR和免疫印跡分析表明NLRP9 mRNA及其蛋白在豬腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2中均能檢測(cè)到表達(dá)。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)該蛋白主要定位在IPEC-J2的細(xì)胞質(zhì)。利用RNA干擾技術(shù)沉默NLRP9基因并用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPEC-J2細(xì)胞活性并未受太大影響,但細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢。再用不同濃度的LPS處理細(xì)胞并在體外培養(yǎng)12小時(shí),檢測(cè)到NLRP9mRNA和蛋白在IPEC-J2細(xì)胞中的表達(dá)量會(huì)隨著LPS濃度的增加而增多,細(xì)胞活性也明顯增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S828
【圖文】：

圖２－１豬ＮＬＲＰ與其他物種的ＮＬＲＰ９系統(tǒng)生化數(shù)逡逑

數(shù)為－０．０１８，所以該蛋白為親水性蛋白，利用ＥＸＰＡＳＹ逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）在線軟件分析ＮＬＲＰ９蛋白的親疏水性，結(jié)逡逑果顯示在１０２位分值最低為－２．６５６，在３４７位最高值為２．４２２，見(jiàn)圖２－２和２－３。逡逑ｆｔ邋ＶＥＢＳＥｖｉ？ＪＥ？；Ｅ邋Ｌｅｎｇｔｈ邋９９６逡逑ｎ邋ＷＥＢＳＥｗＵＥＷ＾邋Ｒｕ？ｂｅｒ邋ｏｆ邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ＴＭＨｓ邋０逡逑８邋ＷＥＢ３ＥｙＵＥ？：Ｅ邋ＥｘＰ邋ｎｉａｋｂ＾ｉ邋ｏｆ邋Ｍｒ邋ｍ邋ＴＭＨｓ邋０．７１５８９逡逑８邋ＶＥＢＳＥＱＴＪＥＷ３Ｅ邋Ｅｘｐ邋ｎ＇ｍｂｅｉ，邋ｆｉｒｓｔ邋６０邋ＡＡｒ邋０逡逑８邋ＶＥＢ３Ｅ＇ｊＵＥ？：Ｅ邋Ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｂ邋ｏｆ邋Ｎ－ｍ邐０．邋００００３逡逑ＷＨＢＳＥＱＵＥＷ．＇Ｅ邋ＴＨＨＭＭ２．０邐ｏｕｔｓｉｄｅ邋１邐９９６逡逑ＴＭＨＭＭ邋ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ邋ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ邋ｆｏｒ邋ＷＥＢＳＥＱＵＥＮＣＥ逡逑１２邋邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐■邐邐邐邐邐邐邐逡逑坌0８逡逑■邋０６邋？逡逑０４邋？逡逑０２邋■逡逑０邋邐１邐１邐１邐１邐邐邐１邐１邐１￣祖…１邐——逡逑０邐１００邐２００邐３００邐４００邐５００邐６００邐７００邐６００邐９００逡逑ｔｒａｎｓｍｅｒＴｉｂｒａｎｅ邋邐邋ｉｎｓｉｄｅ邐邐ｏｕｔｓｉｄｅ邋邐逡逑圖２－２邋ＮＬＲＰ９蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＮＬＲＰ９邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｒｅ

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1 玉香;NLRP9在仔豬組織中的表達(dá)、定位及在IPEC-J2細(xì)胞中的功能研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2725130