發(fā)布時(shí)間：2020-06-22 02:21

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic dirrhea,PED)是由豬流行腹瀉病毒(Porcine epidemic dirrhea virus,PEDV)引起的一種急性、高傳染性豬腸道疾病。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水、厭食和迅速消瘦等,雖然各種年齡階段的豬對(duì)PEDV都易感,但10日內(nèi)的仔豬對(duì)PEDV更易感,致死率高達(dá)100%。1971年,世界上第一例PED暴發(fā)于英格蘭地區(qū)的架子豬和育肥豬群中,癥狀只是表現(xiàn)為腹瀉。1984年,宣華等首次證實(shí)我國某些地區(qū)豬群中也存在PEDV感染。2010年底開始,我國從南到北,從東到西的很多地區(qū)豬場(chǎng)的仔豬腹瀉疫情暴發(fā),并伴隨著新的流行特征出現(xiàn),尤其是發(fā)病率和死亡率高,造成100萬頭仔豬死亡,一周齡仔豬死亡率竟高達(dá)80%-90%,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)PEDV經(jīng)典毒株(CV777)的傳統(tǒng)疫苗不能對(duì)新流行PEDV毒株提供良好的保護(hù);目前,對(duì)于造成PEDV新流行毒株高致病性的機(jī)制尚不明確。抗原變異是導(dǎo)致PEDV經(jīng)典株弱毒/滅活疫苗對(duì)目前流行毒株免疫失敗的主要原因之一。PEDV S蛋白在病毒感染宿主細(xì)胞的吸附、入侵以及膜融合等過程中發(fā)揮重要作用;S蛋白也是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體的主要靶蛋白之一。豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典毒株與流行毒株S蛋白氨基酸序列比對(duì)顯示,其s基因發(fā)生了明顯的變異,且在S蛋白的N-端存在一個(gè)高變區(qū)(1-496aa,S1_(0A))。為了找出S蛋白高變區(qū)因基因突變導(dǎo)致的表位改變,在表位水平解析PEDV新流行毒株的免疫逃避現(xiàn)象,本文主要進(jìn)行了以下研究:1.PEDV S蛋白高變區(qū)(S1_(0A))表達(dá)載體的構(gòu)建以帶有經(jīng)密碼子優(yōu)化的PEDV CV777疫苗株和新流行株P(guān)EDV SD2014 s基因的重組載體為模板,設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增PEDV經(jīng)典株s基因高變區(qū)片段(s1_(0A)~(CV777))和流行株s基因高變區(qū)片段(s1_(0A)~(SD2014)),構(gòu)建2個(gè)表達(dá)載體pET-32a-S1_(0A)~(CV777)和pET-32a-S1_(0A)~(SD2014);將測(cè)序驗(yàn)證正確的PEDV S1_(0A)蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,采用IPTG誘導(dǎo)2段重組蛋白的表達(dá);并對(duì)誘導(dǎo)條件如IPTG濃度、溫度進(jìn)行了優(yōu)化,確定在IPTG濃度在0.8 mmol/L,37℃條件下重組蛋白表達(dá)量較高,并且重組蛋白是以包涵體的形式存在于菌體中。2.免疫新西蘭大白兔制備PEDV S蛋白高變區(qū)多克隆抗體在最優(yōu)條件下大量表達(dá)重組蛋白,超聲波破碎菌體,離心收集包涵體重組蛋白,并采用SDS-PAGE割膠和電洗脫方法純化包涵體蛋白。將純化的2段蛋白各免疫3只新西蘭大白兔(0.5 mg/只),另外設(shè)置一只兔子為對(duì)照組,相同的方法注射PBS。每隔14 d加強(qiáng)免疫1次,共免疫4次;分別于第一次免疫后的第14、28、42、56 d耳部靜脈取血,第58 d頸動(dòng)脈放血后間接ELISA檢測(cè)抗體水平,6只兔子的抗體滴度都高于1:1 638 400,表明免疫得到的多抗兔血清具有良好的敏感性;免疫組化和免疫熒光顯示獲得的抗S1_(0A)~(CV777)和抗S1_(0A)~(SD2014)多克隆抗體都具有很好的特異性。3.PEDV S1_(0A)~(CV777)和S1_(0A)~(SD2014)線性B細(xì)胞表位區(qū)篩選設(shè)計(jì)并合成覆蓋PEDV經(jīng)典株和流行株S蛋白高變區(qū)(1-496aa)全長的互有8 aa重疊的系列16肽編碼DNA,體外退火后插入到表達(dá)載體pXXGST-3中,構(gòu)建表達(dá)載體pXXGST-3-P1~P61,將序列驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,分別以抗S1_(0A)~(CV777)多抗血清和抗PEDV S1_(0A)~(SD2014)多抗血清為一抗Western blot篩選覆蓋S1_(0A)~(CV777)和S1_(0A)~(SD2014)序列全長、彼此重疊8 aa的系列16肽中的陽性反應(yīng)性16肽。利用抗PEDV S1_(0A)~(CV777)多抗血清和抗S1_(0A)~(SD2014)多抗血清在PEDV S1_(0A)~(CV777)上共鑒定到34個(gè)陽性反應(yīng)性16肽。其中,16個(gè)為兩種血清共同識(shí)別的表位肽,12個(gè)為抗PEDV S1_(0A)~(CV777)血清特異性識(shí)別的表位肽,6個(gè)為抗S1_(0A)~(SD2014)血清特異性識(shí)別的表位肽;利用抗PEDV S1_(0A)~(SD2014)多抗血清和抗S1_(0A)~(CV777)多抗血清在PEDV S1_(0A)~(SD2014)上共篩選到28個(gè)陽性反應(yīng)性16肽,其中,13個(gè)為兩種血清共同識(shí)別的表位肽,12個(gè)為抗PEDV S1_(0A)~(SD2014)血清特異性識(shí)別的表位肽,3個(gè)為抗S1_(0A)~(CV777)血清特異性識(shí)別的表位肽。
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.651
【圖文】：

統(tǒng)計(jì)報(bào)告證實(shí)：截止到 2013 年，在有關(guān)政府和科學(xué)家的共同努力下，家的 PED 疫情得到了有效控制。截止目前，美洲國家如美國、阿根廷、哥倫比亞、墨西哥、加拿大、墨西哥等，亞洲國家如韓國[9]、越南、日本、菲律賓、中國和泰國等，歐洲國家如比利時(shí)、英國、法國[8]和荷蘭等的養(yǎng)豬行業(yè)都受到了 PED 的巨大沖擊。 PEDV 形態(tài)和理化性質(zhì)(1) PEDV 形態(tài)PEDV 具有感染性，是尼多病毒目冠狀病毒科α-冠狀病毒屬成員[1]，是一種的正鏈單股線性 RNA 病毒。PEDV 病毒粒子呈現(xiàn)多形性或?yàn)榍蛐危睆?0 nm，其中包括長約 18 nm 的突出部分[1]，基因組核苷酸大約為 28000 nt[15發(fā)現(xiàn)的 PEDV 只有一種血清型[16]。在電子顯微鏡下觀察其病毒粒子，在囊纖突，其排列規(guī)則且由核心向周圍放射呈現(xiàn)皇冠的形態(tài)，因此被稱為冠狀其結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示。

齊魯工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文蛋白（M，27-32 kD）、囊膜蛋白（E，7 kD）和核衣殼蛋白（N，55-58 kD）以及非結(jié)構(gòu)蛋白 ORF3 蛋白。結(jié)構(gòu)模式如圖 1.3 所示[15,18]。在 PEDV 所有的基因組中，復(fù)制酶基因 1a 和 1ab 作用是編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（即復(fù)制酶蛋白 1a 和 1ab），其長度占所有基因組的三分之二。非結(jié)構(gòu)蛋白在 PEDV 復(fù)制、裝配和逃避宿主天然免疫中發(fā)揮重要的作用。

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本文編號(hào)：2725034