【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)一直被認(rèn)為是一種危害性較強(qiáng)的人畜共患病病原體,能夠引起各種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥以及人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽,由于其引起的部分疾病兼具發(fā)病快、死亡率高的特點(diǎn),對畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有極大的潛在威脅性。產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)病的主要因素是其分泌的外毒素,而根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生的主要毒素α(Cpa),β(Cpb),ε(Etx),iota(Cpi),可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E 5種毒素型,其中α、β和ε是最主要的致病毒素。在當(dāng)前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中,接種是最常用的預(yù)防措施,而此類疫苗主要由從產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)物中獲得的類毒素組成。與常規(guī)類毒素相比,重組疫苗具有針對性強(qiáng)、穩(wěn)定性和安全性高以及商業(yè)空間大的特點(diǎn),已經(jīng)作為為一種更加具有前景的免疫接種方案而被廣泛研究。此外,枯草芽孢桿菌作為一種極具潛力的外源蛋白表達(dá)宿主菌,有著人和動(dòng)物作為益生菌和食品添加劑使用的安全記錄,顯著的耐熱性,其不論是用來高效表達(dá)外源蛋白還是作為口服疫苗或全細(xì)胞酶的載體,都展現(xiàn)出其他細(xì)菌無可比擬的優(yōu)勢,是研究較多、應(yīng)用廣泛的生物安全菌。先前的研究已經(jīng)證明了Cpa~(247-370)能夠賦予針對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的攻毒免疫力,而具有H106P突變的Etx~(H106P)被認(rèn)為是用于預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的動(dòng)物疾病的最佳特異性疫苗候選物,而β毒素目前尚未有比較明確的研究證明其有效表位,本研究針對這一現(xiàn)狀,對β毒素的有效表位進(jìn)行了預(yù)測。對β毒素蛋白二級結(jié)構(gòu)、親水性、可塑性、抗原性、氨基酸信號肽序列及切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,建立β毒素蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型。在線服務(wù)器以5個(gè)連續(xù)殘基為最低標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測線性和不連續(xù)的抗原表位,標(biāo)記β毒素蛋白優(yōu)勢抗原表位,篩選、截取并建立新蛋白三維空間結(jié)構(gòu)模型。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Cpb~(108-305),經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21,通過Western免疫印跡分析對表達(dá)產(chǎn)物做出鑒定,結(jié)果顯示在約24kda有明顯條帶。分3組進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn),每組分別口服BL21-pET28a-Cpb~(108-305)菌液(0.2 ml,10 ~(10) CFU/ml)、BL21-Cpb菌液(0.2ml,10 ~(10) CFU/ml)和PBS液(0.2 ml),各組分別在免疫后的第0、7、14、21、28和35 d取3只小鼠從尾靜脈采集血液并分離血清,同時(shí)收集小鼠腸道灌洗液。采用間接ELISA方法對免疫小鼠的血清和腸道灌洗液樣品進(jìn)行檢測,比較新蛋白Cpb~(108-305)與β毒素蛋白之間的免疫效果。結(jié)果表明預(yù)測篩選的新蛋白Cpb~(108-305)與β毒素蛋白的免疫效果基本相同�；谝阎尚械腃pa~(247-370)和Etx~(H106P)表位及預(yù)測的β毒素蛋白的有效抗原表位Cpb~(108-305),本研究近一步構(gòu)建包含α、β和ε三種毒素蛋白保護(hù)性表位的融合蛋白,并選用枯草芽孢桿菌構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)。分別設(shè)計(jì)合成三對特異性引物,利用PCR技術(shù)從B型產(chǎn)氣莢膜梭菌中分別擴(kuò)增出Cpa~(247-370)、Cpb~(108-305)和Etx基因序列,通過SOE-PCR將第74位氨基酸(組氨酸)突變?yōu)楦拾彼?將ε毒素第118位氨基酸(組氨酸)突變?yōu)楦彼?利用SOE-PCR將已擴(kuò)增并突變完成的Cpa~(247-370)、Cpb~(108-305)和Etx~(H106P)三段序列重組連接成一段新的融合序列Cpa~(247-370)-Cpb~(108-305)-Etx~(H106P)(Cpa-b-x)。將PCR擴(kuò)增出來的Cpa-b-x基因片段連接到pHT43表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHT43-Cpa-b-x,基因測序鑒定準(zhǔn)確性。通過電轉(zhuǎn)化方式將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到提前制備好的枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)細(xì)胞中,從LB平板(添加氯霉素抗性)上篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。誘導(dǎo)表達(dá)Cpa-b-x融合蛋白,通過SDS-PAGE和Western Blot對表達(dá)產(chǎn)物做出鑒定,結(jié)果顯示在約71.15 kda附近有明顯條帶,成功表達(dá)了Cpa-b-x融合蛋白。為了評價(jià)融合蛋白的免疫效果,我們進(jìn)一步對融合蛋白進(jìn)行多項(xiàng)免疫檢測。隨機(jī)將175只6周齡SPF小鼠分為5組,分別口服免疫同等劑量枯草芽孢桿菌pHT43-Cpa-b-x(Bs-pHT43-Cpa-b-x)、枯草芽孢桿菌pHT43(Bs-pHT43)、枯草芽孢桿菌(Bs)、Cpa-b-x純化蛋白和PBS,并于初次免疫后第10-14 d和24-28 d加強(qiáng)免疫。分別于接種以后的第0、7、14、21、28、35、42、49 d采集外周血和腸道灌洗液(每組3只),然后通過ELISA方法分別檢測血清抗體及腸道黏膜抗體效價(jià)、血清細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和γ-干擾素(IFN-γ))水平,采用MTT比色法測T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血CD4~+與CD8~+水平。第3次加強(qiáng)免疫后1一周,隨機(jī)從每組選出10只小鼠腹腔注射10×LD_(50)的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌,連續(xù)7d觀察已攻毒小鼠的發(fā)病及死亡情況并及時(shí)記錄,一周后進(jìn)行腸道組織病理檢測。結(jié)果表明,小鼠口服免疫Bs-pHT43-Cpa-b-x后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,免疫保護(hù)效果顯著優(yōu)于其他組,此外,枯草芽孢桿菌一定程度增強(qiáng)了機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究通過對β毒素進(jìn)行預(yù)測,成功篩選出與β毒素具有相似免疫效果的保護(hù)性表位,基于此構(gòu)建出能夠預(yù)防α、β和ε三種毒素的重組融合蛋白Cpa-b-x。研究證明Cpa-b-x蛋白能夠有效提升機(jī)體的免疫防御,對小鼠具有顯著的保護(hù)作用,而枯草芽孢桿菌作為益生菌對機(jī)體也具有一定程度的免疫調(diào)理作用,本研究為產(chǎn)氣莢膜梭菌重組體研究更新了理論數(shù)據(jù),為產(chǎn)氣莢膜梭菌病口服重組疫苗的研究提供了技術(shù)依托。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.616
【圖文】：

圖 1 pHT43-Cpa-b-x 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic diagram of pHT43-Cpa-b-x expression plasmid construction2.3.2 重組產(chǎn)氣莢膜梭菌Cpa-b-x基因PCR擴(kuò)增從NCBI中檢索獲取羊產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因序列 Cpa（GeneBank登錄號：AY823400.1） Cpb（GeneBank登錄號：KP064408.1）和 Etx（GeneBank登錄號：JX010451.1） 根據(jù)枯草芽孢桿菌 pHT43 表達(dá)質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)信息，選取 BamHI和 SmaI 作為本研究的酶切位點(diǎn)，根據(jù)酶切位點(diǎn)及 Cpa Cpb 及 Etx 序列信息設(shè)計(jì)以下引物：表 7 用于獲取 Cpb108-305 Cpb108-305和 ETXH106P毒素蛋白序列的引物Table 7 Primer for obtaining Cpb108-305, Cpb108-305and ETXH106Ptoxin protein sequence名稱 引物序列（5′-3′）F2 GGATCCATGTATGCAGCA

圖 2. β 毒素蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Prediction of secondary structure of β-toxin protein3.1.1.2 親水性、表面可及性和可塑性蛋白親水性以及表面可及性是決定蛋白三維結(jié)構(gòu)和可接觸性的重要因素(于天飛等, 2007) 根據(jù) Kyte-Doolittle 的方案測得的結(jié)果如圖所示，β 毒素蛋白整體親水性較高，30~300 區(qū)段基本均為親水性，且 70%左右親水性較強(qiáng)，只有 N 端以及中間小部分為疏水性區(qū)域；Emini 方案預(yù)測蛋白表面可及性顯示蛋白分子表面可及性高的區(qū)域相對較多，主要位于分子外表面，其中 N 端和 C 端表面可及性均較低；采用 Karplus Schulz的方案預(yù)測 β 毒素蛋白的可塑性，結(jié)果顯示可塑性較高區(qū)域集中在 30~300 區(qū)段，分布較為均勻，以 120~230 區(qū)段最佳 結(jié)合親水性，表面可及性及可塑性綜合分析，30~300區(qū)段親水性強(qiáng) 表面可及性高 可塑性好，此段滿足形成表位的客觀條件，形成表位的概率較大

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2724796