【摘要】：霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌,是流行性病霍亂的病原體�；魜y弧菌的侵染周期分為兩個階段:一個階段處于體外的水生環(huán)境,另一個階段處于宿主體內(nèi)的腸道環(huán)境�；魜y弧菌生物被膜的形成無論是在體外的水生環(huán)境還是在體內(nèi)的腸道環(huán)境中對于霍亂弧菌的生存而言都發(fā)揮了巨大的作用。而霍亂弧菌的IV型菌毛(MSHA,Mannose-sensitive Hemagglutinin)對于生物被膜的形成至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)霍亂弧菌進(jìn)入宿主腸道后MSHA基因簇的表達(dá)受到抑制,然而在感染霍亂的病人的糞便中可觀察到以生物被膜形式存在的霍亂弧菌。因此,我們推測霍亂弧菌很可能在侵染初期需要抑制MSHA菌毛的表達(dá),以逃逸宿主天然免疫系統(tǒng)的攻擊,然而在侵染后期又需要形成新的生物被膜,以便其進(jìn)入下一個侵染周期。然而,霍亂弧菌中MSHA基因簇的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。MshH是大腸桿菌調(diào)節(jié)蛋白CsrD的同源物,是一種特殊而復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控級聯(lián)的組成部分。在大腸桿菌中CsrD能夠增強(qiáng)對調(diào)控蛋白CsrA與mRNA的結(jié)合具有抑制作用的RNase E的依賴性降解,而在霍亂弧菌中其功能未知。本研究旨在探究mshH基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。首先構(gòu)建霍亂弧菌基因表達(dá)文庫,利用熒光報告系統(tǒng)對該基因文庫進(jìn)行篩選,通過對2.5萬菌株的篩選,發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中VC1371能特異性的激活mshH的轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步確定VC1371蛋白是否直接調(diào)控mshH基因的表達(dá),利用過鎳柱純化的方法成功純化得到VC1371蛋白,通過凝膠電泳遷移實驗(EMSA,Electrophoretic Mobility Shift Assay),結(jié)果發(fā)現(xiàn)VC1371可以與mshH的啟動子序列結(jié)合,經(jīng)過熒光素酶報告系統(tǒng)檢測,發(fā)現(xiàn)mshH在霍亂弧菌vc1371基因缺失突變株(?vc1371)中的表達(dá)相比較野生型明顯減弱。通過分析突變株生物被膜的形成情況,發(fā)現(xiàn)當(dāng)VC1371缺失后,生物被膜的形成減少。這說明在霍亂弧菌中VC1371可以調(diào)控mshH的轉(zhuǎn)錄,并通過對mshH的調(diào)控作用影響霍亂弧菌生物被膜的形成。通過制備MshA多克隆抗體并對霍亂弧菌野生型菌株和?vc1371的MshA蛋白水平進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MshA在?vc1371中的表達(dá)量相比野生型減弱。而在VC1371回補(bǔ)株中MshA表達(dá)量得到恢復(fù),甚至比野生型更高。這說明,霍亂弧菌VC1371可能通過激活mshH的表達(dá)從而調(diào)控MshA的合成。為了驗證VC1371對mshH的調(diào)控是否在霍亂弧菌宿主定殖過程中發(fā)揮作用,將?vc1371和vc0398的基因缺失突變株(?vc0398)分別與野生型菌株進(jìn)行乳鼠和成鼠的腸道競爭定殖實驗,結(jié)果表明?vc1371與?vc0398在乳鼠腸道中的定殖能力比野生型菌株要強(qiáng),而?vc1371與?vc0398在四周齡的成鼠中的定殖能力均比野生型要弱。綜上所述,本研究證明了VC1371可以特異性激活霍亂弧菌中mshH的表達(dá),VC1371的缺失會使mshH的啟動子表達(dá)減弱、MshA蛋白表達(dá)降低以及生物被膜的形成減少,并且VC1371蛋白可以在體外與mshH的啟動子序列結(jié)合。最后發(fā)現(xiàn)?vc1371與?vc0398在霍亂弧菌感染的初期和后期的宿主定殖中發(fā)揮了一定的作用。本研究結(jié)果為研究MSH基因簇的表達(dá)調(diào)控以及生物膜形成的分子機(jī)制方面奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

的轉(zhuǎn)化的平板上長出的0 管。每個庫再吸取 1 m每個庫再按照“1 mL 菌液載體酶切驗證法，成功提取了霍亂弧菌值為 1.8~2。將基因組進(jìn)驗證如圖 2.1 所示。載體24-Km，泳道 2 為酶切后

載體酶切驗證法，成功提取了霍亂弧菌值為 1.8~2。將基因組驗證如圖 2.1 所示。載體24-Km，泳道 2 為酶切后 2.1 霍亂弧菌基因組酶切ication of Vibrio cholerae gen

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本文編號：2724670