發(fā)布時(shí)間：2020-06-21 19:42

【摘要】：腿肌和胸肌是水禽骨骼肌的重要組成部分,兩者在肌纖維類型、發(fā)育規(guī)律等方面存在顯著差異。前人的研究主要集中于胸肌的發(fā)育特征及其調(diào)控機(jī)制方面,而腿肌發(fā)育的分子機(jī)理研究報(bào)道較少。因此,本研究以發(fā)育不同時(shí)期櫻桃谷肉鴨胚胎期腿肌為研究材料,首先,從組織學(xué)和基因表達(dá)水平解析胚胎期腿肌發(fā)育規(guī)律;其次,利用RNA-seq和miRNA-seq技術(shù)篩選鴨胚胎期腿肌發(fā)育不同時(shí)期的差異表達(dá)基因、差異表達(dá)miRNAs以及調(diào)控的差異信號(hào)通路;再次,從細(xì)胞水平探討在發(fā)育不同時(shí)期均存在顯著差異的miR-33a調(diào)控鴨成肌細(xì)胞增殖的的分子機(jī)制;最后,從細(xì)胞水平探討卵泡抑素(Follistatin,FST)調(diào)控鴨成肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。研究結(jié)果如下:(1)鴨胚胎期腿肌發(fā)育過(guò)程主要分為成肌細(xì)胞增殖期、肌管期和肌纖維期,且三個(gè)時(shí)期對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn):11胚齡(E11)、19胚齡(E19)和27胚齡(E27)。(2)RNA-seq結(jié)果的分析表明,E11與E19相比存在1182個(gè)顯著差異表達(dá)的基因(DEGs)(FDR≤0.01),875個(gè)上調(diào),307個(gè)下調(diào);E19與E27相比存在1967個(gè)DEGs(FDR≤0.01),1052個(gè)上調(diào),915個(gè)下調(diào);E11與E27相比存在1484個(gè)DEGs(FDR≤0.01),654個(gè)上調(diào),830個(gè)下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)從肌管發(fā)育成肌纖維階段的差異基因數(shù)多于成肌細(xì)胞發(fā)育成肌管階段。(3)miRNA-seq結(jié)果的分析表明,E11與E19相比存在194個(gè)顯著差異表達(dá)的已知miRNAs(FDR≤0.01),105個(gè)調(diào),89個(gè)下調(diào);E19與E27相比存在550個(gè)顯著差異表達(dá)的已知miRNAs(FDR≤0.01),156個(gè)上調(diào),394個(gè)下調(diào);E11與E27相比存在369個(gè)顯著差異表達(dá)的已知miRNAs(FDR≤0.01),143個(gè)上調(diào),226個(gè)下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)從肌管發(fā)育成肌纖維階段的差異miRNAs數(shù)多于成肌細(xì)胞發(fā)育成肌管階段。(4)miRNA-seq結(jié)果預(yù)測(cè)出新miRNAs在發(fā)育的不同時(shí)期差異如下:E11與E19相比存在7個(gè)顯著差異表達(dá)的新miRNAs(FDR≤0.01),5個(gè)上調(diào),2個(gè)下調(diào);E19與E27相比存在25個(gè)顯著差異表達(dá)的新miRNAs(FDR≤0.01),3個(gè)上調(diào),22個(gè)下調(diào);E11與E27相比存在9個(gè)顯著差異表達(dá)的新miRNAs(FDR≤0.01),2個(gè)上調(diào),7個(gè)下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)肌管發(fā)育成肌纖維階段比成肌細(xì)胞發(fā)育成肌管階段存在更多的差異新miRNAs,差異新miRNAs在肌管發(fā)育成肌纖維的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。(5)RNA-seq和miRNA-seq的KEGG分析表明,p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上富集的差異基因較多;采用熒光定量PCR方法驗(yàn)證了p53信號(hào)通路上Zinc finger protein RFP-like 1、DNAJC6、ZSWIM2、CDKL2、CDK14、CCNB3、RRM2、CCNB2、Cytochrome c-like共9個(gè)基因的mRNA水平的表達(dá)量,其表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。該研究暗示此三個(gè)信號(hào)通路可能是調(diào)控鴨胚胎期腿肌發(fā)育差異的重要信號(hào)通路。(6)miRNA-seq結(jié)果的分析表明miR-33a的表達(dá)在腿肌發(fā)育的三個(gè)時(shí)期間存在顯著差異,miR-33a的表達(dá)量在鴨成肌細(xì)胞增殖期顯著高于其余兩個(gè)時(shí)期;在成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-33a后能通過(guò)靶向抑制IGF-1、FST和CCND1,并抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)抑制鴨成肌細(xì)胞增殖。(7)過(guò)表達(dá)FST基因的結(jié)果表明,FST過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)成肌細(xì)胞活性和促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖,FST過(guò)表達(dá)促進(jìn)鴨成肌細(xì)胞增殖的機(jī)制主要通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。綜上所述,本研究從組織和細(xì)胞水平探討了鴨胚胎期腿肌發(fā)育不同時(shí)期在基因表達(dá)和miRNAs表達(dá)上的差異,并對(duì)影響鴨胚胎期腿肌發(fā)育的關(guān)鍵miRNAs、調(diào)控基因及調(diào)控的信號(hào)通路進(jìn)行了功能研究,為系統(tǒng)全面的闡述骨骼肌發(fā)育的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S834

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