【摘要】：超數(shù)排卵-胚胎移植(Multiple Ovulation and Embryo Transfer,MOET)技術(shù)是優(yōu)秀牛群快速擴(kuò)繁的有效技術(shù)手段。但是,近50年來,在實際生產(chǎn)中奶牛超排效果一直沒有得到明顯提升,且不同牛只對外源促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)處理的反應(yīng)程度存在巨大差異。因此,研究影響MOET效果的因素,尤其是FSH對超排的影響,對于提高M(jìn)OET效果具有重要意義。超排效果良好維持的基礎(chǔ)是卵泡能夠正常發(fā)育和排卵,而卵泡的正常發(fā)育又依賴于類固醇激素(孕激素、雄激素、雌激素等)與促性腺激素(促卵泡素、促黃體素)等激素的調(diào)節(jié)。因此,研究FSH對卵泡類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響可能為提高M(jìn)OET效率提供新的途徑。本研究首先建立牛有腔卵泡的體外培養(yǎng)模型,在該基礎(chǔ)上添加外源FSH,研究FSH對卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期為改善牛的超排效果提供理論支持。本研究內(nèi)容主要包括2個方面,研究結(jié)果如下:試驗一:不同直徑奶牛有腔卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)。試驗通過qRT-PCR檢測荷斯坦奶牛卵巢不同大小有腔卵泡(3-4 mm,5-8 mm,8 mm以上)的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞內(nèi)類固醇合成酶基因(CYP11A1、3β-HSD、CYP19A1、CYP17A1、17β-HSD)和促性腺激素受體基因(FSHR、LHR)的表達(dá)水平。顆粒細(xì)胞研究結(jié)果顯示CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD、FSHR和LHR在大卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量皆顯著高于中小卵泡(P0.05),而中小卵泡組之間表達(dá)量差異不顯著(P0.05);17β-HSD在不同組卵泡之間表達(dá)量差異皆不顯著(P0.05)。膜細(xì)胞研究結(jié)果顯示CYP11A1、3β-HSD、17β-HSD和FSHR在不同組膜細(xì)胞之間表達(dá)量皆沒有顯著性差異(P0.05)。CYP17A1和LHR在大卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于中小卵泡(P0.05)。此外,研究結(jié)果還證實同一時期卵泡顆粒細(xì)胞中FSHR表達(dá)量遠(yuǎn)高于LHR,而膜細(xì)胞中LHR遠(yuǎn)高于FSHR,說明顆粒細(xì)胞中以表達(dá)FSHR為主,膜細(xì)胞中以表達(dá)LHR為主。試驗二:FSH對體外培養(yǎng)牛有腔卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞類固醇合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。分離牛卵泡(9-11 mm),用添加不同濃度FSH的DMEM/F12進(jìn)行24 h體外培養(yǎng)。qRT-PCR檢測外源FSH處理對牛卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞類固醇合成酶基因(CYP11A1、3β-HSD、CYP19A1、CYP17A1、17β-HSD)和促性腺激素受體基因(FSHR、LHR)表達(dá)的影響。顆粒細(xì)胞的研究結(jié)果顯示,25 ng/mL FSH處理顯著上調(diào)了CYP11A1的表達(dá)(P0.05),10 ng/mL FSH處理顯著上調(diào)了3β-HSD的表達(dá)(P0.05),50 ng/mL FSH處理顯著上調(diào)CYP19A1的表達(dá)(P0.05)。膜細(xì)胞的研究結(jié)果表明,50 ng/ml FSH處理顯著上調(diào)CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD的表達(dá)(P0.05),但是也觀察到10和25 ng/mL FSH處理顯著下調(diào)CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的表達(dá)(P0.05)。對FSHR和LHR的研究結(jié)果顯示在顆粒細(xì)胞中,與對照組相比,25 ng/mL FSH處理顯著上調(diào)FSHR的表達(dá)(P0.05),10 ng/mL FSH處理顯著上調(diào)LHR表達(dá)(P0.05),50 ng/mL FSH處理對顆粒細(xì)胞FSHR、LHR表達(dá)沒有顯著影響(P0.05);而50 ng/mL FSH處理卻顯著上調(diào)了膜細(xì)胞LHR的表達(dá)(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

不同動物體內(nèi) FSH 的半衰期并不相同，其中商品 FSH（NIH-FSH-s8）在牛體約為 300 min(Laster, 1972)。FSH 是卵泡的募集和生長進(jìn)程中不可或缺的激素(Fortune, 2003)，其對雌性家畜的主是促進(jìn)卵泡發(fā)育和雌激素的合成與分泌，以及卵泡顆粒細(xì)胞/膜細(xì)胞上 LH 受體的表達(dá)卵泡（原始卵泡）可通過卵巢自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)，由原始卵泡貯存庫開始發(fā)育進(jìn)入，而無需 FSH 的作用，但是當(dāng)卵泡發(fā)育到有腔卵泡時期則需要在 FSH 的作用下才能優(yōu)勢卵泡，否則卵泡將發(fā)生閉鎖。作為生物大分子，F(xiàn)SH 不能直接透過細(xì)胞膜，需經(jīng) FSH 受體（FSHR）的介導(dǎo)。FSH偶聯(lián)受體家族成員之一，在雌性動物卵巢內(nèi)主要分布于顆粒細(xì)胞表面，在卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞膜表面也有分布(王文芳. 2016; 李成嬌, 2011)。當(dāng) FSH 與 FSHR 結(jié)合后，F(xiàn)SH 誘導(dǎo)發(fā)生變化，激活細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶，胞內(nèi) cAMP 濃度升高，從而影響著細(xì)胞的代謝 卵泡發(fā)育模式研究表明，母牛出生時卵巢上原始卵泡數(shù)約為 10-15 萬枚，雖然初情期前也可能有卵泡發(fā)育的卵泡并不能排卵而發(fā)生閉鎖，只有到了初情期后（母牛為 10 月齡左右）卵巢生殖激素的作用下，才能優(yōu)勢化并排卵。牛是單胎動物，其卵巢卵泡發(fā)育呈現(xiàn)顯著的（1）一個發(fā)情周期只有一枚卵泡發(fā)育成熟并排卵，極少數(shù)有 2 枚卵泡成熟排卵（見圖

有 2 個卵泡發(fā)育波的母牛卵巢卵泡示意圖（引自《牛繁殖技能手冊A schematic map of cow ovarian follicles with three follicular developm有 3 個卵泡發(fā)育波的母牛卵巢卵泡示意圖（引自《牛繁殖技能手冊A schematic map of cow ovarian follicles with three follicular developm泡發(fā)育的調(diào)控機(jī)制期胚胎發(fā)育過程中就已形成原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ細(xì)胞。PGCs 通常起源于生殖腺以外的胚胎上胚層，隨后 ts, et al., 2010)。當(dāng)原始生殖細(xì)胞進(jìn)入性腺脊后便分化成為

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