【摘要】：目的:隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷進(jìn)步,轉(zhuǎn)基因動物的研究也不斷取得新的進(jìn)展。目前使用常規(guī)的轉(zhuǎn)基因生物(如細(xì)菌、昆蟲等)生產(chǎn)糖基化藥用蛋白的生產(chǎn)能力受到很大的限制,利用轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)糖基化藥用蛋白的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器具有世代周期短、飼養(yǎng)成本低、繁殖快和產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn),使其成為生產(chǎn)藥用蛋白的理想選擇。輸卵管特異性表達(dá)的目的蛋白最終在雞蛋蛋清中表達(dá),而且蛋清中卵清蛋白含量高、組分比較簡單,有利于目的蛋白的分離與純化。以上諸多優(yōu)點(diǎn)使雞輸卵管生物反應(yīng)器在生物制藥領(lǐng)域擁有良好的應(yīng)用前景。本研究的目的是通過PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的方法將γ-hIFN目的基因整合到雞的基因組中,最終獲得輸卵管特異性表達(dá)γ-hIFN的轉(zhuǎn)基因雞。方法:(1)本研究首先根據(jù)前人的研究經(jīng)驗(yàn),結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的條件對雞胚換殼培養(yǎng)體系進(jìn)行了探索,建立穩(wěn)定的雞胚換殼培養(yǎng)操作流程,并對雞胚盤下腔注射體內(nèi)感染復(fù)合物的注射量進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn),尋找最佳的注射量;(2)利用實(shí)驗(yàn)室己構(gòu)建的pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和pLenti6.4-CMV-EGFP載體分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞和原代雞輸卵管上皮細(xì)胞驗(yàn)證cERE/cOVP啟動子的活性;(3)以實(shí)驗(yàn)室保存的pLenti6.4-CMV-γ-hIFN、pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和PUC57-P2A-RFP載體為模板,分別擴(kuò)增cERE/cOVP、y-hIFN片段和P2A-RFP片段,通過重疊PCR將γ-hIFN片段和P2A-RFP片段連接起來構(gòu)建表達(dá)盒。然后將cERE/cOVP和γ-hIFN-P2A-RFP片段分別亞克隆至無啟動子的PB002G轉(zhuǎn)座子載體Nhel/Mfel和AscI酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建特異性表達(dá)載體PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,并將γ-hIFN-P2A-RFP表達(dá)盒克隆至PB-dual-promotor轉(zhuǎn)座子載體的Mfel與Nhel酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP表達(dá)載體,將PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞和原代雞輸卵管上皮細(xì)胞,檢測γ-hIF N和RFP表達(dá)。(4)利用in-vivo jetPEI轉(zhuǎn)染試劑,將PB002G-cER E/cOVP-y-hIFN-P2A-RFP和PBase轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒進(jìn)行X期雞胚胚盤下腔注射,孵化到第14天取雞胚組織器官提取基因組DNA,PCR檢測目的基因在雞胚的基因組中的整合情況。結(jié)果:(1)胚盤下腔顯微注射注射量為2.5ul最為合適。(2)p Lenti6.4-cERE/cOVP-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,cERE/cOVP啟動子能夠成功啟動EGFP在HEK 293T細(xì)胞和雞原代輸卵管上皮細(xì)胞中表達(dá),說明該啟動子能夠發(fā)揮啟動功能。(3)成功構(gòu)建了 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-Dual-CMV-y-hIFN-P2A-RFP轉(zhuǎn)座子載體,分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞和雞原代輸卵管上皮細(xì)胞,通過顯微鏡觀察熒光表達(dá)、RT-PCR、細(xì)胞免疫熒光和Western Blot檢測到了 y-hIFN和RFP基因的表達(dá)。(4)對45枚種蛋進(jìn)行雞胚盤下腔注射轉(zhuǎn)座子載體PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,孵化14天后雞胚存活17枚,存活率為37.78%,取雞胚的心臟和性腺組織提取基因組DNA,進(jìn)行PCR檢測目的基因整合效率,最終在4個(gè)雞胚心臟組織、2個(gè)性腺組織DNA樣本中檢測到了γ-hIFN基因的整合,其中1個(gè)樣本在心臟和性腺組織DNA中同時(shí)檢測到了γ-hIFN基因的整合。本研究初步證明了轉(zhuǎn)座子載體能夠介導(dǎo)γ-hIFN[基因整合至雞胚基因組,為PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)輸卵管特異性表達(dá)γ-hIFN轉(zhuǎn)基因雞研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;S831
【圖文】：

圖１－１邋ＰｉｇｇｙＢａｃ轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座機(jī)制逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋ＰｉｇｇｙＢａｃ邋ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈｎｉｓｉｍ逡逑３雞胚換殼培養(yǎng)體系逡逑與哺乳動物受精卵不同的是，雞的受精卵結(jié)構(gòu)比較特殊。雞的受精卵在體內(nèi)受

２．邋６討論逡逑本實(shí)驗(yàn)首先對雞胚換殼培養(yǎng)操作流程進(jìn)行了研宄，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室操作條件，對部分逡逑操作進(jìn)行了優(yōu)化，是整個(gè)換殼流程能夠安全順利的進(jìn)行。為保證整個(gè)過程無菌，雞蛋逡逑經(jīng)過嚴(yán)格消毒后在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行切殼、換殼、封膜等操作，所有實(shí)驗(yàn)器材都經(jīng)過逡逑高溫高壓消毒滅菌，確保雞蛋的內(nèi)部環(huán)境始終處于無菌狀態(tài)，這是換殼之后雞胚的繼逡逑續(xù)發(fā)育的基本要求。在選擇第二次換殼所需的ｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩＩ代用蛋殼時(shí)，由于沒有火雞逡逑蛋，我們采用容易購買的重量符合要求的雙黃蛋作為替代品，并證明雙黃蛋殼可以用逡逑作ｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩＩ代用蛋殼，通過不斷地改進(jìn)換殼培養(yǎng)的操作流程最終獲得了邋３３．５１％的平逡逑均出殼率。在操作中根據(jù)李贊東等［５２］等提出的封口膜通透性不夠水分蒸發(fā)會在封口膜逡逑上形成水珠影響雞胚的發(fā)肓，我們選用了通透性更好的ｐａｒａｆｉｌｍ封口膜，再保持蛋殼逡逑內(nèi)部無菌的同時(shí)使水分能夠透過封口膜散發(fā)出去，避免了在封口膜內(nèi)部形成水珠。在逡逑正常孵化過程中翻蛋的角度也是一個(gè)重要的影響因素，Ｇｏｔｏ等［８９］人曾嘗試不翻蛋的情逡逑況下進(jìn)行孵化僅獲得了邋２１．３％的出殼率，日本的研究人員指出當(dāng)翻蛋角度大于４５°時(shí)逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫研研;蔣斌;鄭江霞;徐桂云;曲魯江;楊寧;;胚盤下腔注射法將外源質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入雞胚的研究[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2010年04期

2 張海玲;閆喜軍;;干擾素研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年04期

3 滿朝來;陳巖;;逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備轉(zhuǎn)基因雞的方法分析[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2007年08期

4 ;抗瘋牛病轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛在高青基地降生[J];萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年02期

5 趙英會,張念華,杜立新;雞卵清蛋白表達(dá)調(diào)控[J];生物技術(shù);2004年04期

6 王嶸,洪國藩,韓斌;水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RIRE10拷貝數(shù)與LTR區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2003年08期

7 李贊東，杜國清，周順伍，齊順章;在代用蛋殼中孵化雞胚[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);1994年06期

8 韋平;基因轉(zhuǎn)移的主要進(jìn)展[J];中國家禽;1988年05期

9 張智清,侯云德,李玉英,趙小俠,周園,段淑敏,姚立紅;應(yīng)用P_RP_L串聯(lián)啟動子和CIts857調(diào)控基因高效表達(dá)人γ干擾素[J];病毒學(xué)報(bào);1988年02期

10 侯云德,林建新,周建華,段淑敏;利用TGATG序列在大腸桿菌中直接表達(dá)非融合的人αD型干擾素[J];病毒學(xué)報(bào);1985年04期

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1 曹代男;基于慢病毒的輸卵管特異表達(dá)人溶菌酶轉(zhuǎn)基因雞制備[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2723006